一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法技术

本发明专利技术涉及一种细胞程序降温方法，尤其涉及一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法。一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法，步骤包括：1)冻存液配制：离心管中加入DMSO和间充质干细胞无血清基础培养基，摇晃混合均匀后加入人血白蛋白，摇晃混合均匀，预冷；(2)脐带间充质干细胞的冻存：收集细胞于离心管中，计数，加入预冷的冻存液，重悬后，吸取细胞悬浮液于冻存管中，然后在程序降温仪中进行程序降温；(3)程序降温完成后，转入液氮罐中保存。细胞冻存复苏后，活性更高，其存活率为95％以上。活率为95％以上。

【技术实现步骤摘要】
一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法


[0001]本专利技术涉及一种细胞程序降温方法，尤其涉及一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，它能够发育成硬骨、软骨、脂肪和其他类型的细胞，因此已成为细胞治疗的重要候选种子细胞。
[0003]由于干细胞治疗的应用越来越多，人脐带间充质干细胞作为间充质干细胞的一种，其是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。目前对研究主要在人脐带间充质干细胞的液氮保存，人脐带间充质干细胞主要采用非程控温冷冻法和程序降温冷冻法，非程控温冷冻法是直接将人脐带间充质干细胞冷冻鱼
‑
196℃的液氮下，这种方法保存的最大缺点在于，冷冻过程中有大量冰晶产生，影响复苏后细胞的存活率；而程序降温冷冻法存在冷冻时间过长、冻存液不选择与程序接不相匹配，也会在一定程度上影响细胞复苏后的存活率。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术的第一个方面提供了一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法，步骤包括：
[0005](1)冻存液配制：离心管中加入DMSO和间充质干细胞无血清基础培养基，摇晃混合均匀后加入人血白蛋白，摇晃混合均匀，预冷；
[0006](2)脐带间充质干细胞的冻存：收集细胞于离心管中，计数，加入预冷的冻存液，重悬后，吸取细胞悬浮液于冻存管中，然后在程序降温仪中进行程序降温；
[0007](3)程序降温完成后，转入液氮罐中保存。
[0008]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述间充质干细胞无血清基础培养基与人血白蛋白的体积比为1：(1.2～1.3)。
[0009]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述DMSO占冷存液体积的9～11％。
[0010]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述人血白蛋白的浓度为10～20％。
[0011]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述步骤(1)的预冷温度为2～8℃；预冷温度时间至少30min。
[0012]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述冻存管在放入程序降温仪的运输过程中，冻存管在2～8℃低温运输，运输时间控制在15min内。
[0013]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述细胞加入细胞悬浮液的细胞密度为8
×
106/ml～1.2
×
107/ml。
[0014]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述冻存管中细胞悬液的灌装量为3～4mL。
[0015]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述程序降温所用的时间为50～54min。
[0016]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述程序降温的步骤包括：
[0017]第一步，4℃等待2～3min；
[0018]第二步，以1℃/min的速度降温至
‑
8℃；
[0019]第三步，以25℃/min的速度降温至
‑
48℃；
[0020]第四步，以10℃/min的速度升温至
‑
18℃；
[0021]第五步，以1℃/min的速度降温至
‑
48℃；
[0022]第六步，以10℃/min的速度降温至
‑
90℃。
[0023]有益效果：
[0024]1.建立了人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法，经过本专利技术的程序降温步骤后，细胞可以比较好的冻存在液氮中；
[0025]2.本专利技术程序降温的时间小于54min，缩短了程序降温的周期，减小了细胞的损伤，从而提高了冻存后细胞的存活率；
[0026]3.在本专利技术的冻存液中选择了合适浓度的DMSO和人血白蛋白结合程序降温后，复苏后的细胞具有较好的细胞活力和存活率；
[0027]4.当细胞悬浮液的细胞密度一定时，结合冻存液和程序降温选择了合适的细胞悬液的灌装量，使得冻存液能够很好的对细胞进行保护；
[0028]5.细胞冻存复苏后，活性更高，其存活率为95％以上。
附图说明
[0029]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0030]图中：图1指的是实施例1中A2与A3的生长曲线图。
具体实施方式
[0031]参选以下本专利技术的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本专利技术的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本专利技术所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
[0032]如本文所用术语“由
…
制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
[0033]连接词“由
…
组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由
…
组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
[0034]当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围
下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
[0035]单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
[0036]说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本专利技术并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本专利技术不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法，其特征在于，步骤包括：(1)冻存液配制：离心管中加入DMSO和间充质干细胞无血清基础培养基，摇晃混合均匀后加入人血白蛋白，摇晃混合均匀，预冷；(2)脐带间充质干细胞的冻存：收集细胞于离心管中，计数，加入预冷的冻存液，重悬后，吸取细胞悬浮液于冻存管中，然后在程序降温仪中进行程序降温；(3)程序降温完成后，转入液氮罐中保存。2.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法，其特征在于，所述间充质干细胞无血清基础培养基与人血白蛋白的体积比为1：(1.2～1.3)。3.根据权利要求1或2所述的一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法，其特征在于，所述DMSO占冷存液体积的9～11％。4.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法，所述人血白蛋白的浓度为10～20％。5.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法，所述步骤(1)的预冷温度为2～8℃；预冷温度时间至少30min。6.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法，所述冻存管在放入程序降温仪的...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱灏，
申请(专利权)人：华夏源细胞工程集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：