一种滋养层细胞的保存方法技术

本发明专利技术涉及一种滋养层细胞的保存方法。所述保存方法包括洗涤滋养层细胞，将洗涤后的滋养层细胞与冻存液混合，依次进行第一次降温处理、γ射线照射、第二次降温处理，最后置于液氮中保存，所述冻存液包括1640培养基、脐带血血清、二甲基亚砜和羟乙基淀粉。本发明专利技术的保存方法中，采用含有1640培养基、脐带血血清、二甲基亚砜和羟乙基淀粉的冻存液，能够有效保护滋养层细胞，防止滋养层细胞在射线照射过程中被过度破坏，保护滋养层细胞的完整性，提高诱导激活自然杀伤细胞的效果。活自然杀伤细胞的效果。活自然杀伤细胞的效果。

【技术实现步骤摘要】
一种滋养层细胞的保存方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种滋养层细胞的保存方法，尤其涉及一种工程化K562细胞的保存方法。

技术介绍

[0002]自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，是人体抵抗癌细胞和病毒感染的第一道防线，可非特异性直接杀伤肿瘤细胞，还具有免疫调节功能，能够与机体其它多种免疫细胞相互作用，调节机体的免疫状态和免疫功能。临床研究发现NK细胞过继性免疫治疗恶性肿瘤具有良好的应用前景，对多种实体瘤和血液系统恶性肿瘤均有一定效果。
[0003]因子法是常用的NK细胞扩增培养方法之一，抽取外周血或利用单细胞采集机并结合淋巴细胞分离液获得外周血单个核细胞(PBMC)，然后使用滋养层(饲养层)细胞诱导扩增PBMC制备NK细胞。
[0004]在制备NK前需先制备并保存滋养层细胞，现有技术中在制备滋养层细胞后常通过射线处理滋养层细胞使其失去增殖能力，并在低温下进行保存，如CN106085957A提供了一种微载体三维扩增并激活自然杀伤细胞的方法，采用辐照灭活后的饲养层细胞扩增NK细胞；刘尧等筛选并建立稳定、高效的胚胎干细胞滋养层细胞体外培养的最佳条件(参见：刘尧,杨明,王惠,等.γ射线预处理制备胚胎干细胞滋养层的实验研究[J].医学研究杂志,2010(4).)，但射线辐射会一定程度的破坏细胞结构，影响诱导激活自然杀伤细胞的效果，造成损失。
[0005]综合上述，如何提供一种滋养层细胞的保存方法，能够有效避免滋养层细胞的损失，是滋养层细胞领域亟待解决的问题。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种滋养层细胞的保存方法，所述保存方法能够有效保护滋养层细胞，防止滋养层细胞在射线照射过程中被过度破坏，保护滋养层细胞的完整性。
[0007]为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]本专利技术提供一种滋养层细胞的保存方法，所述保存方法包括：
[0009]洗涤滋养层细胞，将洗涤后的滋养层细胞与冻存液混合，依次进行第一次降温处理、γ射线照射、第二次降温处理，最后置于液氮中保存，所述冻存液包括1640培养基、脐带血血清、二甲基亚砜和羟乙基淀粉。
[0010]本专利技术的保存方法中，采用含有1640培养基、脐带血血清、二甲基亚砜和羟乙基淀粉的冻存液，能够有效保护滋养层细胞，防止滋养层细胞在射线照射过程中被过度破坏，保护滋养层细胞的完整性，提高诱导激活自然杀伤细胞的效果。
[0011]优先地，所述1640培养基、脐带血血清、二甲基亚砜和羟乙基淀粉的体积比为(4～
6):(3～5):(0.4～0.6):(0.4～0.6)，包括但不限于4.2:3.5:0.5:0.5、4.5:4:0.45:0.45、4.8:4.2:0.5:0.55、5:4.8:0.55:0.55或5.5:4.5:0.48:0.5。
[0012]优选地，所述脐带血血清预先进行传染病的安全性检测。
[0013]优选地，所述脐带血血清预先进行实验室的安全性检测。
[0014]优选地，所述脐带血血清预先经56℃补体灭活处理20min，并于2000
×
g离心10min去除沉淀。
[0015]优选地，所述滋养层细胞包括工程化K562细胞。
[0016]优选地，所述工程化K562细胞表达膜蛋白CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L。
[0017]优选地，所述CD19包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
[0018]SEQ ID NO:1：
[0019]MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHL。
[0020]优选地，所述CD86包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
[0021]SEQ ID NO:2：
[0022]MGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIPWITAVLPTVIICVMVFCLILWKWKKKKRPRNSYKCGTNTMEREESEQTKKREKIHIPERSDEAQRVFKSSKTSSCDKSDTCF。
[0023]优选地，所述IL
‑
21通过与CD8α跨膜区形成IL
‑
21
‑
CD8α融合蛋白表达在所述NK滋养层细胞表面。
[0024]优选地，所述IL
‑
21
‑
CD8α包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
[0025]SEQ ID NO:3：
[0026]MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDSGSYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC。
[0027]优选地，所述CD64包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
[0028]SEQ ID NO:4：
[0029]MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSF本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种滋养层细胞的保存方法，其特征在于，所述保存方法包括：洗涤滋养层细胞，将洗涤后的滋养层细胞与冻存液混合，依次进行第一次降温处理、γ射线照射、第二次降温处理，最后置于液氮中保存；所述冻存液包括1640培养基、脐带血血清、二甲基亚砜和羟乙基淀粉。2.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述1640培养基、脐带血血清、二甲基亚砜和羟乙基淀粉的体积比为(4～6):(3～5):(0.4～0.6):(0.4～0.6)；优选地，所述脐带血血清预先经补体灭活处理。3.根据权利要求1或2所述的保存方法，其特征在于，所述滋养层细胞包括工程化K562细胞；优选地，所述工程化K562细胞表达膜蛋白CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L；优选地，所述IL
‑
21通过与CD8α跨膜区融合表达在所述工程化K562细胞表面。4.根据权利要求3所述的保存方法，其特征在于，所述CD19包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；优选地，所述CD86包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；优先地，所述IL21
‑
CD8α包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；优先地，所述CD64包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；优先地，所述CD137L包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的保存方法，其特征在于，所述保存方法包括以下步骤：(1)离心收集滋养层细胞；(2)将步骤(1)得到的滋养层细胞与生理盐水混合，进行离心，收集滋养层细胞，重复1～2次；(3)将步骤(2)得到的滋养层细胞与冻存液混合，并进行第一次降温处理，得到混合液；(4)使用γ射线照射所述混合液，进行第二次降温处理...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵礼军，熊建民，
申请(专利权)人：河南省华隆生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：