本发明专利技术涉及一种防治棉花枯萎病的生防菌株，命名为Pseudomonas alloputida Pa2，保藏日期为2020年11月9日，保藏编号：CGMCC NO.21149；本发明专利技术的生防菌株生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可以通过简单、快捷低成本的制备方法获得防治棉花枯萎病的生防制剂；其抑菌效果非常明显，经过试验证明，本发明专利技术提供的生防制剂在温室盆栽条件下对棉花枯萎病的防效达到了74.48％，田间条件对棉花枯萎病的防效达到了70.11％，显著优于对照，进而大幅度促进农民增收。大幅度促进农民增收。
【技术实现步骤摘要】
一种防治棉花枯萎病的生防菌株、生防菌剂及其制备方法与应用
[0001]本专利技术涉及微生物应用
，具体涉及一种防治棉花枯萎病的生防菌株、生防菌剂及其制备方法与应用。
技术介绍
[0002]棉花枯萎病是全球性两大棉花病害之一，对世界各产棉国的棉花生产都造成了不同程度的影响，我国也深受其害。尖孢镰刀菌萎蔫专化型真菌(Fusarium oxysporum f.sp.Vasinfectum)是棉花枯萎病的病原菌，它在自然条件下很容易存活，能够产生分生孢子，主要通过土壤、种子和肥料进行传播。尖孢镰刀菌通常只侵染棉花、秋葵和红麻等少数植物，在温室或病圃接种条件下，可以侵染麦类、茄科、豆科、瓜类和烟草等多种植物。棉花枯萎病是典型的维管束病害，棉花在整个生长发育期均可染病。有很多种类型的发病症状，苗期有青枯型、黄化型、皱缩型、黄色网纹型、红叶型等；蕾期有皱缩型、枯斑型、半边黄化型、顶枯型、光秆型等。该病常造成棉花前期大量死苗，后期叶片及蕾铃大量脱落，甚至枯死。我国棉花枯萎病的重灾区发病率高达60％
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70％，死苗率达35％
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40％，一般造成减产20％～30％左右。棉花枯萎病的防治是提高棉花产量的重要途径之一。
[0003]目前防治棉花枯萎病的主要方法有药物防治、科学的田间管理和选用抗病品种。这些方法有各自的优点和局限。化学药剂在棉花病害防治中有一定的作用，在棉花枯萎病的防治中应用也比较广泛。通常在播种前用稀释的抗菌剂402药液或多菌灵胶悬剂浸种，以达到杀灭病原菌的目的。常见的杀菌农药有多菌灵、甲基托布津、56％醚菌酯百菌清、41％聚砹嘧霉胺、克黄枯、20％硅唑咪鲜胺、枯黄基因素、棉花三清等。化学药剂用于零星病区的病株和局部土壤处理效果较显著。然而，化学药剂毒性较大，且绝大多数药剂都易挥发，农药经过口、吸呼道或直接接触而大量进入施药人体内，易引起急性中毒。且绝大多数化学药都具有致癌、致畸、致突变的性质，农药进入食物链后，会在各级消费者体内积累，严重危害人和动物的健康。
[0004]科学的田间管理包括轮作、秋耕深翻、合理密植、及时清除病苗等方法。但受到种植习惯和自然环境的影响，轮作在推广应用时存在一定困难，且枯萎病菌在土壤中存活的时间较长，短期轮作达不到明显的防治效果，长期轮作又不容易实施。秋耕深翻和合理密植等田间管理方法均无法彻底杀灭病原菌，对棉花枯萎病的防治作用有限。
[0005]使用抗病品种是一种经济有效的防病措施，目前应用比较广泛。但抗病品种的选育周期较长，研发成本较高；有些品种抗性尚不能满足生产需要；棉花枯萎病菌易变异，存在致病力分化的现象，当大面积栽培单一抗病品种时，存在抗病性丧失的风险。
[0006]因此，开发成本低、效果好、环境友好、健康、可持续的生物防治方法，是当前棉花枯萎病的防治中面临的急需解决的难题。当前虽有一些棉花枯萎病的生防菌被研究，但由于棉花枯萎病特殊的生物学特性，这些生防菌的田间防效始终差强人意，至今没有成功在生产一线大面积推广的生防菌剂的问世。
技术实现思路
[0007]本专利技术的目的是为了解决以上现有技术的不足，提供一种可以防治棉花枯萎病的细菌菌株，还提供了一种包含上述细菌菌株的生防菌剂，可以很好地应用于棉花枯萎病的防治工作中。
[0008]为实现本专利技术的上述目的，采用了以下技术方案：
[0009]一种防治棉花枯萎病的生防菌株，命名为Pseudomonas alloputida Pa2，保藏日期为2020年11月9日，保藏地址：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号：CGMCC NO.21149。
[0010]本专利技术的防治棉花枯萎病的生防菌株Pseudomonas alloputida Pa2，为2019年在南京市溧水区某农场韭菜根围土壤中分离得到。
[0011]分离方法：采用5点取样法取韭菜根围土壤后分别装入灭菌的封口塑料袋中，立即带回实验室。将土样5g加入45mL无菌水中，150r/min下于摇床振荡培养1h后，使用无菌纱布过滤得悬浮液并采用10倍系列稀释法得到10
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6倍稀释液。分别取100μL稀释液均匀涂布于LB平板上，于28℃恒温培养箱中培养48h后，挑取颜色、光泽度、大小和类型不同的单菌落，划线纯化菌株，统一编号后转入于LB斜面培养基中，用80％灭菌甘油保存，置于
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70℃保存备用。
[0012]平板对峙法：选取培养2d的棉花枯萎病菌菌饼(5mm)置于PDA平板中央，在距离菌饼25mm处呈三点对称的3个点打孔(直径5mm)并注入100μL供试菌株的发酵培养液，以加入100μLNB为对照。28℃恒温培养48h后，观察和测量抑菌带的大小，实验重复三次，选出抑菌圈最大的菌株，即为Pseudomonas alloputida Pa2。
[0013]生物学特性：革兰氏阴性菌，杆状或卵圆形，菌体大小长(1.5～5.0)μm
×
宽(0.5～1)μm，有鞭毛，无芽胞，无荚膜。菌落形态：圆形，表面光滑，不透明，边缘完整。
[0014]含有所述Pseudomonas alloputida Pa2的生防菌剂也属于本申请要求保护的范围，制备方法为是将菌株Pa2经菌体活化、种子培养、扩大培养后得到。
[0015]具体的制备方法优选包括以下步骤：将Pseudomonas alloputida Pa2在LB培养基中，25～30℃、150～200rpm振荡培养12～24h，获得种子液；将种子液以1％的接种量接种于基础盐培养基，于25～30℃、150～200rpm振荡培养，获得活菌总浓度为1
×
109～1
×
10
10
CFU/mL的生防菌剂成品。
[0016]本专利技术还提供了一种上述生防菌株或生防菌剂在防治棉花枯萎病中的应用。
[0017]具体方法为：在使用前，将制得的生防菌剂稀释至1
×
107CFU/mL，灌根处理。
[0018]本专利技术的有益效果如下：
[0019](1)生防菌剂中含有抑制棉花枯萎病病原菌生长的专一性菌株Pseudomonas alloputida Pa2，其抑菌效果非常明显，经过试验证明，本专利技术提供的生防制剂在温室盆栽条件下对棉花枯萎病的防效达到了74.48％，田间条件对棉花枯萎病的防效达到了70.11％，显著优于对照。
[0020](2)本专利技术的Pseudomonas alloputida Pa2，生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可以通过简单、快捷低成本的制备方法获得防治棉花枯萎病的生防菌剂。
[0021](3)本专利技术提供的生防菌剂为微生物防治剂，无公害，不产生环境污染，可以减少甚至不用其他相应化学农药，不仅节省农民开支，还提高稻米品质。
[0022](4)经过试验证明，本专利技术提供的生防菌剂，具有抗病作用，进而大幅度促进农民增收。
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种防治棉花枯萎病的生防菌株，其特征在于，命名为Pseudomonas alloputida Pa2，保藏日期为2020年11月9日，保藏编号：CGMCC NO.21149。2.含有权利要求1所述生防菌株的生防菌剂。3.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于，生防菌剂中活菌总浓度为1
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109～1
×
10
10
CFU/mL。4.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于，所述的生防菌剂由权利要求1所述的水丛毛单胞菌菌株经菌体活化、种子培养、扩大培养后得到。5.一种如权利要求4所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩先旭，贾思振，张磊，牛冬冬，郭威，
申请(专利权)人：南京振旭生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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