一种细胞培养液的收获方法技术

本发明专利技术公开了一种细胞培养液的收获方法。所述方法包括以下步骤：1)提供宿主细胞，对宿主细胞进行种子复苏、摇瓶扩增培养和流加培养，得到细胞密度不小于1.0

【技术实现步骤摘要】
一种细胞培养液的收获方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养领域，具体而言，涉及一种细胞培养液的收获方法。

技术介绍

[0002]经过几十年发展，细胞培养技术已经成为生产很多重要蛋白的成熟技术。目前在细胞培养领域常用的细胞培养液收获方法包括：絮凝、沉淀、离心和深层过滤。其中离心和深层过滤对于某些特定培养基成分的细胞收获液不能有效分离，并且通过离心或深层过滤获得的细胞收获液的浊度高。另外，深层过滤方法中使用的深层过滤膜的包载量低，也会影响细胞培养液的收获以及目标产物的收率。通过絮凝或沉淀收获细胞培养液，主要作用为去除宿主细胞蛋白(HCP)、DNA、细胞碎片、培养基组分。
[0003]现有技术中，提高深层过滤膜包载量的能力有限，而且需要配合特定的膜包，且膜包的使用数量显著大于同类产品，从而增加了生产设备和设施的操作负荷，存在生产失败的风险。另外，使用深层过滤膜收获细胞培养液还会不可避免的造成产品的生产成本增加，降低了产品的市场竞争力。

技术实现思路

[0004]专利技术要解决的问题
[0005]针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供了一种针对使用特定培养基培养宿主细胞、收获包含目标产物的细胞培养液的方法。
[0006]用于解决问题的方案
[0007]本专利技术人鉴于上述现有技术中存在的问题，进行了深入的研究、反复试验，通过对细胞培养液收获工艺进行优化，从而完成了本专利技术。即本专利技术如下所述：
[0008]一种细胞培养液的收获方法，所述方法包括以下步骤：r/>[0009]1)提供宿主细胞，对宿主细胞进行种子复苏、摇瓶扩增培养和流加培养，得到细胞密度不小于1.0
×
106个/mL的细胞培养物；
[0010]2)向步骤1)中所述细胞培养物中添加酸性溶液，调节细胞培养物的pH为4.0～5.6，其中所述酸性溶液含有枸橼酸、醋酸、磷酸、正辛酸及其盐中的一种及一种以上；
[0011]3)对步骤2)所述的细胞培养物进行深层过滤和/或添加碱性溶液，得到细胞培养液，其中所述碱性溶液含有Tris、Tris
‑
bis、组氨酸中的一种及一种以上；
[0012]4)收获步骤3)所述的细胞培养液。
[0013]在一些实施方式中，在上述细胞培养液的收获方法中，其特征在于，在步骤3)中首先对步骤2)所述的细胞培养物进行深层过滤，得到细胞收集液，然后再向所述细胞收集液中添加碱性溶液、将所述细胞收集液的pH调节为5.0～8.0，从而得到相应的细胞培养液；优选的，在所述步骤2)之前或者在所述步骤2)之后额外增加对所述细胞培养物进行连续流离心机离心的操作。
[0014]在一些实施方式中，在上述细胞培养液的收获方法中，其特征在于，在步骤3)中首
先向步骤2)所述的细胞培养物中添加碱性溶液、将所述细胞培养物的pH调节为5.0～8.0，然后再将所述细胞培养物进行深层过滤，从而得到相应的细胞培养液；优选的，在添加碱性溶液、将所述细胞培养物的pH调节为5.0～8.0之后或者在所述步骤2)之前额外增加对所述细胞培养物进行连续流离心机离心的操作。
[0015]根据上文所述的细胞培养液的收获方法，其特征在于，在步骤1)中使用基础培养基M对所述宿主细胞进行种子复苏和摇瓶扩增，使用流加试剂A和流加试剂B对所述宿主细胞进行流加培养；其中，所述基础培养基M溶解后pH为7.3～7.5，浊度为0.5～1NTU，渗透压为300～350mOsm/kg，葡萄糖含量为5～6g/L，其中谷氨酰胺、羟脯氨酸、丙氨酸、肌氨酸和脯氨酸的含量均小于40μmol/L；所述流加试剂A溶解后pH为6.5～6.8，浊度为1.5～2.5NTU，渗透压为1500～1800mOsm/kg，葡萄糖含量>75.02g/L，其中天门冬氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸的含量均大于10000μmol/L；所述流加试剂B溶解后pH为11～11.5，浊度为1～1.5NTU，渗透压为1200～1500mOsm/kg，其中组氨酸、酪氨酸、胱氨酸和色氨酸的含量均大于10000μmol/L；优选的，在所述流加培养中，当溶液中葡萄糖的浓度低于4.0g/L时，补加葡萄糖使溶液中葡萄糖的浓度提高到5.0g/L，并根据实际泡沫量加入总量不超过100ppm的消泡剂。
[0016]在一些实施方式中，上文所述基础培养基M中天门冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸的含量均大于10％(w/w)，且所述基础培养基M中不包含谷氨酰胺、羟脯氨酸、丙氨酸、肌氨酸和脯氨酸；上文所述流加试剂A中谷氨酸、丝氨酸、亮氨酸的含量均大于10％(w/w)，且所述流加试剂A中不含组氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、正缬氨酸、羟脯氨酸和肌氨酸；上文所述流加试剂B中组氨酸、酪氨酸、胱氨酸和色氨酸的含量均大于10％(w/w)，且所述流加试剂B中不含天门冬酰胺、苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、羟脯氨酸和肌氨酸；优选的，所述流加试剂B中酪氨酸的含量为45～55％(w/w)。
[0017]在一些实施方式中，所述基础培养基M、流加试剂A和流加试剂B中的氨基酸组成如表1所示。
[0018]根据上文所述的细胞培养液的收获方法，其特征在于，所述深层过滤中使用的膜包选自Millipore公司的D0HC、D0SP、X0HC、X0SP、20MS、40MS系列中的任意一种或任意两种的组合；优选的，所述膜包的过滤载量大于等于60升每平方米。
[0019]在一些实施方式中，上文所述细胞培养液的收获方法中的宿主细胞为哺乳动物细胞；优选的，所述哺乳动物细胞选自由CHO、DXB
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11、DG
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44、CHO/
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DHFR、CV1、COS
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7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL3A、W138、Hep G2、SK
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Hep、MMT、TRI、MRC5、FS4、T细胞系、B细胞系、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS
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0、U20S、HT1080、L929、融合瘤以及癌细胞系组成的组；更优选的，所述哺乳动物细胞为CHO
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S或CHO
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K1细胞。
[0020]在一些实施方式中，所述哺乳动物细胞包含编码外源蛋白的核苷酸序列；优选的，所述外源蛋白为抗体；更优选的，所述抗体为单克隆抗体或双特异性抗体。
[0021]具体的，在本专利技术的一个方面提供一种细胞培养液的收获方法A，所述方法包括以下步骤：
[0022]a)细胞培养：采用生物反应器培养，接种密度不小于1.0
×
106个/mL，细胞培养的基础培养基为基础培养基M，流加培养基为流加试剂A和流加试剂B(培养基特点详见表1～2)，培养温度33.0℃～36.5℃，葡萄糖低于4.0g/L时，补加葡萄糖本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞培养液的收获方法，所述方法包括以下步骤：1)提供宿主细胞，对宿主细胞进行种子复苏、摇瓶扩增培养和流加培养，得到细胞密度不小于1.0
×
106个/mL的细胞培养物；2)向步骤1)中所述细胞培养物中添加酸性溶液，调节细胞培养物的pH为4.0～5.6，其中所述酸性溶液含有枸橼酸、醋酸、磷酸、正辛酸及其盐中的一种及一种以上；3)对步骤2)所述的细胞培养物进行深层过滤和/或添加碱性溶液，得到细胞培养液，其中所述碱性溶液含有Tris、Tris
‑
bis、组氨酸中的一种及一种以上；4)收获步骤3)所述的细胞培养液。2.根据权利要求1所述的细胞培养液的收获方法，其特征在于，在步骤3)中首先对步骤2)所述的细胞培养物进行深层过滤，得到细胞收集液，然后再向所述细胞收集液中添加碱性溶液、将所述细胞收集液的pH调节为5.0～8.0，从而得到相应的细胞培养液；优选的，在所述步骤2)之前或者在所述步骤2)之后额外增加对所述细胞培养物进行连续流离心机离心的操作。3.根据权利要求1所述的细胞培养液的收获方法，其特征在于，在步骤3)中首先向步骤2)所述的细胞培养物中添加碱性溶液、将所述细胞培养物的pH调节为5.0～8.0，然后再将所述细胞培养物进行深层过滤，从而得到相应的细胞培养液；优选的，在添加碱性溶液、将所述细胞培养物的pH调节为5.0～8.0之后或者在所述步骤2)之前额外增加对所述细胞培养物进行连续流离心机离心的操作。4.根据权利要求1～3任一项中所述的细胞培养液的收获方法，其特征在于，在步骤1)中使用基础培养基M对所述宿主细胞进行种子复苏和摇瓶扩增，使用流加试剂A和流加试剂B对所述宿主细胞进行流加培养；其中，所述基础培养基M溶解后pH为7.3～7.5，浊度为0.5～1NTU，渗透压为300～350mOsm/kg，葡萄糖含量为5～6g/L，其中谷氨酰胺、羟脯氨酸、丙氨酸、肌氨酸和脯氨酸的含量均小于40μmol/L；所述流加试剂A溶解后pH为6.5～6.8，浊度为1.5～2.5NTU，渗透压为1500～1800mOsm/kg，葡萄糖含量>75.02g/L，其中天门冬氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸的含量均大于10000μmol/L；所述流加试剂B溶解后pH为11～11.5，浊度为1～1.5NTU，渗透压为1200～1500mOsm/kg，其中组氨酸、酪氨酸、胱氨酸和色氨酸的含量均大于10000μmol/...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨忠华，秦婷，王亚东，黄海峰，王晓玉，
申请(专利权)人：信达生物制药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：