一种新冠病毒S1-RBD蛋白羊驼纳米抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种新冠病毒S1

【技术实现步骤摘要】
一种新冠病毒S1
‑
RBD蛋白羊驼纳米抗体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及抗体制备
，尤其是涉及一种新冠病毒S1
‑
RBD蛋白羊驼纳米抗体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]羊驼的免疫系统在检测到细菌和病毒等外来入侵者时会产生两种类型的抗体：一种类似于人抗体IgG，另一种只有四分之一大小，这些较小的抗体称为单域抗体或纳米抗体(即缺失轻链的“重链抗体”)，这种缺失轻链的重链抗体只有很小的片段也能和正常的IgG等抗体一样去结合抗原，直接利用大肠杆菌培养噬菌体就可以获得大量的纳米抗体。
[0003]新型冠状病毒蛋白分为刺突糖蛋白(S蛋白，spike protein)、包膜糖蛋白(E蛋白)、膜糖蛋白(M蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白)。在冠状病毒中起关键作用的S蛋白包含2个亚单位，即S1和S2。S1蛋白能够促进病毒与宿主细胞受体的结合，其含有一个重要的C端RBD结构域，正是这个区域负责和受体结合。
[0004]目前，市场上的新冠检测试剂盒只有新冠病毒核酸检测试剂盒和新冠病毒抗体检测试剂盒两大类，既没有应用于该领域的新冠病毒羊驼抗体，也没有应用新冠病毒羊驼抗体检测新冠病毒蛋白的检测试剂盒，更没有极具临床应用价值、可开发为治疗新冠病毒肺炎临床药物的具有中和病毒能力的羊驼纳米抗体。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种新冠病毒S1
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RBD蛋白羊驼纳米抗体及其制备方法和应用，该新冠病毒S1
‑
RBD蛋白羊驼纳米抗体在用于新冠病毒检测时大大提高了检测诊断的特异性和准确性，同时该抗体还具有中和新冠病毒的中和活性，在作为新冠病毒肺炎治疗的纳米抗体药物上具有良好的应用前景。
[0007]本专利技术提供一种新冠病毒S1
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RBD蛋白羊驼纳米抗体的制备方法，包括：
[0008]A)从免疫羊驼的外周血淋巴细胞中提取总RNA，并反转录扩增cDNA；
[0009]B)以cDNA为模板扩增羊驼抗体VHH基因，将其与载体连接构建噬菌体文库；
[0010]C)从噬菌体文库中筛选阳性克隆；
[0011]D)利用阳性克隆构建羊驼纳米抗体表达载体，经诱导表达和纯化，获得新冠病毒S1
‑
RBD蛋白羊驼纳米抗体。
[0012]在本专利技术中，所述免疫羊驼是经重组新冠病毒S1蛋白免疫的羊驼；具体地，免疫时重组新冠病毒S1蛋白的剂量可以为0.4mg/只；每隔2周进行一次免疫，在第6次免疫2周后获得免疫羊驼。
[0013]在本专利技术中，反转录扩增cDNA包括：
[0014]向RNase free离心管中加入5
×
gDNA digester Mix 6μL和总RNA 2μg，加RNase free超纯水至总体积为30μL，混匀，于42℃孵育2分钟，得到反应液；
[0015]向所述反应液中加入ⅢSuperMix plus 10μL，混匀后进行反转录，反转录程序为：25℃5分钟，55℃15分钟，85℃5分钟。
[0016]在本专利技术中，采用巢式PCR扩增羊驼抗体VHH基因，包括：
[0017]以cDNA为模板进行第一轮PCR扩增，得到第一轮扩增产物；第一轮PCR扩增体系为：2
×
phanta mix 25μL，Primer F 0.5μL，Primer R 0.5μL，模板cDNA 2μL，ddH2O至总体积50μL；第一轮PCR扩增程序为：96℃5min，95℃20s，65℃20s，72℃20s，72℃5min，25℃∞，32个循环；
[0018]利用第一轮扩增产物进行第二轮PCR扩增，得到第二轮扩增产物；第二轮PCR扩增体系为：2
×
phanta mix 25μL，Primer F 0.5μL，Primer R 0.5μL，第一轮扩增产物50ng，ddH2O至总体积50μL；第一轮PCR扩增程序为：96℃5min，95℃20s，58℃20s，72℃20s，72℃5min，25℃∞，32个循环。
[0019]在本专利技术中，构建噬菌体文库包括：
[0020]采用Sfi I对第二轮PCR扩增产物和载体pHEN1进行酶切，酶切后回收载体和羊驼抗体VHH基因并进行连接反应，得到连接产物；
[0021]将连接产物转化至TG
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1感受态细胞中，培养至OD600达到0.7后，加入辅助噬菌体继续培养，收细菌培养上清，获得噬菌体文库。
[0022]在本专利技术中，可以采用包被有重组新冠病毒S1蛋白的酶联板对噬菌体文库进行筛选，得到阳性克隆。
[0023]进一步地，本专利技术的制备方法还包括：
[0024]对噬菌体文库进行放大培养、分离、亲和筛选、鉴定、测序，得到羊驼抗体VHH基因序列。
[0025]在本专利技术中，可以将阳性克隆中富集度较高的序列亚克隆到pET22b载体上，获得羊驼纳米抗体表达载体。
[0026]本专利技术还提供一种新冠病毒S1
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RBD蛋白羊驼纳米抗体，按照上述制备方法制得。
[0027]本专利技术还提供新冠病毒S1
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RBD蛋白羊驼纳米抗体在检测新冠病毒蛋白或作为新冠病毒抗体药物的应用。
[0028]本专利技术的实施，至少具有以下优势：
[0029]1、本专利技术制备的新冠病毒S1
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RBD蛋白羊驼纳米抗体，填补了新冠病毒血清学检测市场中ELISA检测试剂盒中没有羊驼抗体的空白，该羊驼抗体可用于研发检测新冠病毒蛋白的诊断试剂盒，大大提高了检测诊断的特异性和准确性；
[0030]2、本专利技术的抗新冠病毒S1
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RBD蛋白的羊驼抗体具有中和新冠病毒的能力，其有望作为中和抗体用于新冠病毒肺炎抗体药物的研发，从而为新冠病毒的研发打下坚实的基础。
附图说明
[0031]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0032]图1为本专利技术构建噬菌体文库载体pHEN1的质粒图谱；
[0033]图2为本专利技术新冠病毒S1
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RBD蛋白羊驼纳米抗体中和新冠病毒试验的结果。
具体实施方式
[0034]应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0035]下面将结合实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新冠病毒S1
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RBD蛋白羊驼纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括：A)从免疫羊驼的外周血淋巴细胞中提取总RNA，并反转录扩增cDNA；B)以cDNA为模板扩增羊驼抗体VHH基因，将其与载体连接构建噬菌体文库；C)从噬菌体文库中筛选阳性克隆；D)利用阳性克隆构建羊驼纳米抗体表达载体，经诱导表达和纯化，获得新冠病毒S1
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RBD蛋白羊驼纳米抗体；优选地，免疫羊驼是经重组新冠病毒S1
‑
RBD蛋白免疫的羊驼。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，免疫时重组新冠病毒S1
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RBD蛋白的剂量为0.2
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0.8mg/只，优选为0.4mg/只；优选地，每隔2周进行一次免疫，在第6次免疫2周后获得免疫羊驼。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，反转录扩增cDNA包括：向RNase free离心管中加入5
×
gDNA digester Mix 6μL和总RNA 2μg，加RNase free超纯水至总体积为30μL，混匀，于42℃孵育2分钟，得到反应液；向所述反应液中加入4
×Ⅲꢀ
SuperMix plus10μL，混匀后进行反转录，反转录程序为：25℃ 5分钟，55℃ 15分钟，85℃ 5分钟。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，采用巢式PCR扩增羊驼抗体VHH基因，包括：以cDNA为模板进行第一轮PCR扩增，得到第一轮扩增产物；第一轮PCR扩增体系为：2
×
phanta mix 25μL，Primer F 0.5μL，Primer R 0.5μL，模板cDNA 2μL，ddH2O至总体积50μL；第一轮PCR扩增程序为：96℃ 5min，95℃ 20s...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡克平，陈兴，钱朝晖，白丽荣，王友军，王建勋，张晨，李国红，徐国良，牛延革，张一鸣，陈雷，刘炎，郑磊，张娜，闫旭南，张伟，赵瑞鑫，
申请(专利权)人：安第斯抗体生物技术衡水有限公司，
类型：发明
国别省市：