一种高效制备霍乱弧菌菌影的方法技术

本发明专利技术提供了一种高效制备霍乱弧菌菌影的方法，包括：在霍乱弧菌工程菌的培养过程中加入阿拉伯糖进行诱导，诱导培养1～3h后，再次加入阿拉伯糖进行二次诱导：在诱导阶段，当检测到溶氧值突然下降时，添加卡那霉素，继续培养0.5～1.5h后活菌数目为0；诱导培养4～6h后，菌影形成率达到99％以上。本发明专利技术利用二次诱导策略，缩短诱导时间，收获菌影量提高了16％以上，且内毒素含量降低至初始工艺的1/5以下，显著提高了生产效率，降低生产成本；本发明专利技术制备的霍乱弧菌菌影形态均匀、完整，活菌数目为0，无需再进行灭活处理，安全性更高。

【技术实现步骤摘要】
一种高效制备霍乱弧菌菌影的方法
本专利技术属于微生物培养
，具体涉及一种高效制备霍乱弧菌菌影的方法。
技术介绍
20世纪80年代奥地利学者LubitzW等首先研发了一种新型疫苗——菌影疫苗(VaccineofBacterialGhost)。细菌菌影(BacterialGhost，BG)是一种不含胞浆成分的完整细菌空壳，其基本原理是噬菌体PhiXl74的E蛋白能将革兰阴性菌裂解，裂解后的革兰阴性菌在细胞膜形成一个跨膜孔道结构，使菌内胞质内容物由孔道排出。这种灭活的细菌空壳作为疫苗使用其免疫原性要优于传统灭活疫苗。霍乱弧菌菌影(VibrioCholeraeGhosts，VCG)可作为递呈系统，且VCG载体本身具有佐剂的性质，可产生很好的体液和细胞免疫应答。VCG在疫苗生产中的应用，不仅能够有效刺激机体的免疫应答，抵抗病原的感染，同时能够产生免疫记忆，抵抗病原的再次感染，同时具有无需佐剂、无致病性、安全性好、能够长时间稳定存在、可作为载体构建多价重组疫苗等优点。在我们之前的研究(CN109355221B)中，通过培养基组分筛选、诱导时间确定、以及诱导条件优化等，实现了霍乱弧菌菌影的高密度发酵。但是，在该工艺中，诱导时间(菌影形成率达到99％以上时需要诱导11h)过长，降低了设备利用率，增加了工人工作时间。同时，较长的诱导时间，一方面导致部分菌影破碎，失去了完整的菌影结构，另一方面，由于菌影破碎导致较高的内毒素含量；部分菌影的破碎和内毒素的升高，均会影响霍乱弧菌菌影作为疫苗及疫苗佐剂的品质。另外，利用该工艺虽然菌影形成率可以达到99％以上，但是仍有少数丢失质粒的霍乱弧菌存在，极大地影响了霍乱弧菌菌影作为疫苗的安全性，进而需要进一步灭活处理，例如添加0.4％甲醛37℃灭活48h进行处理。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术目的在于提供一种高效制备霍乱弧菌菌影的方法，主要是制定了一种全新的菌影诱导培养及制备策略。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种高效制备霍乱弧菌菌影的方法，包括如下步骤：S1、挑取霍乱弧菌工程菌株的单菌落，接种至种子培养基中，培养8～14h，获得霍乱弧菌种子液；S2、将霍乱弧菌种子液接种至发酵培养基中，培养至菌液的吸光度值在600nm为4.5～5.5时，加入阿拉伯糖进行诱导；S3、诱导培养1～3h后，再次加入阿拉伯糖进行二次诱导；S4、在诱导阶段，当检测到溶氧值突然下降时(即“溶氧拐点”)，添加卡那霉素，继续培养0.5～1.5h后活菌数目为0；S5、诱导培养4～6h后，菌影形成率达到99％以上。进一步地，在所述诱导培养的同时，按照1.0mL/min的补加速率补加营养物质与抗生素，所述营养物质与抗生素包括：甘油5.0～8.0mL/L、酵母粉50～80g/L和氨苄霉素150～250mg/L。优选地，所述营养物质与抗生素包括：甘油5.0mL/L、酵母粉50g/L、氨苄霉素200mg/L。优选地，在步骤S2中，所述霍乱弧菌种子液的接种量按5％～10％进行。优选地，在步骤S2中，所述培养是在33～35℃、溶氧水平20～30％、pH值7.30～7.50的条件下，培养时间为5～8h；所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖2.0～8.0g/L、酵母粉2.0～10.0g/L、蛋白胨1.0～5.0g/L、柠檬酸1.0～2.0g/L、KCl1.0～3.0g/L、MgSO4·7H2O1.0～3.0g/L、(NH4)2SO41.0～3.0g/L、甜菜碱0.5～1.5g/L、VB115～25mg/L、VH3～8mg/L、氨苄霉素50～150mg/L和氯化胆碱0.5～1.5mL/L，其pH值为7.30～7.50。优选地，在步骤S2中，所述阿拉伯糖的加入量为1.0～4.0g/L；更优选地，所述阿拉伯糖的加入量为2.0g/L。优选地，在步骤S3中，所述阿拉伯糖的再次加入量为1.0～4.0g/L；更优选地，所述阿拉伯糖的加入量为2.0g/L。优选地，在步骤S4中，在诱导培养3.5～4.5h时添加卡那霉素。优选地，所述诱导阶段的pH值维持在7.30～7.50，溶氧水平控制在20～30％，温度控制在28～30℃。本专利技术的有益效果在于：本专利技术利用二次诱导策略，缩短诱导时间，菌影形成率达到99％以上所需的诱导培养时间由技术改进前的11h缩短至4h，且收获菌影量提高了16％以上，显著提高了生产效率，降低生产成本；本专利技术创造性地利用在诱导阶段的溶氧拐点时添加卡那霉素，使霍乱弧菌活菌数目降至0，提高霍乱弧菌菌影制备的安全性，并且避免了采用甲醛等进一步灭活处理对菌影安全性影响和增加繁重的工作量；本专利技术工艺不仅有效缩短诱导培养时间，高效制备霍乱弧菌菌影，并且使内毒素含量降至改进前工艺的1/5以下，且制备的菌影形态均匀、完整，降低了霍乱弧菌菌影的生产成本，提高其安全性和有效性。附图说明图1a：二次诱导时阿拉伯糖添加浓度对霍乱弧菌细菌浓度的影响；图1b：二次诱导时阿拉伯糖添加浓度对活菌数目(抗性平板)的影响；图1c：二次诱导时阿拉伯糖添加浓度对活菌数目(非抗性平皿)的影响；图1d：二次诱导时阿拉伯糖添加浓度对菌影形成率(通过抗性平皿菌数计算)的影响；图1e：二次诱导时阿拉伯糖添加浓度对菌影形成率(通过非抗性平皿菌数计算)的影响；图2a：二次诱导时阿拉伯糖添加时间对霍乱弧菌细菌浓度的影响；图2b：二次诱导时阿拉伯糖添加时间对活菌数目(抗性平板)的影响；图2c：二次诱导时阿拉伯糖添加时间对活菌数目(非抗性平皿)的影响；图2d：二次诱导时阿拉伯糖添加时间对菌影形成率(通过抗性平皿菌数计算)的影响；图2e：二次诱导时阿拉伯糖添加时间对菌影形成率(通过非抗性平皿菌数计算)的影响；图3a：诱导培养阶段搅拌转速的变化情况；图3b：诱导培养阶段溶氧水平的变化情况图4：抗生素种类对活菌数目的影响；图5：卡那霉素的添加浓度对活菌数目的影响；图6a：霍乱弧菌菌影制备工艺改进前后细菌浓度的比较；图6b：霍乱弧菌菌影制备工艺改进前后活菌数目(抗性平皿)的对比；图6c：霍乱弧菌菌影制备工艺改进前后活菌数目(非抗性平皿)的对比；图6d：霍乱弧菌菌影制备工艺改进前后菌影形成率(通过抗性平皿菌数计算)的对比；图6e：霍乱弧菌菌影制备工艺改进前后菌影形成率(通过非抗性平皿菌数计算)的对比；图6f：霍乱弧菌菌影制备工艺改进前后收获菌泥质量的对比；图7a：本专利技术工艺制备的霍乱弧菌菌影形态；图7b：改进前工艺制备的霍乱弧菌菌影菌影形态；图8：霍乱弧菌菌影制备工艺对内毒素含量的影响。具体实施方式下面通过具体的实施方案叙述本专利技术。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效制备霍乱弧菌菌影的方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、挑取霍乱弧菌工程菌株的单菌落，接种至种子培养基中，培养8～14h，获得霍乱弧菌种子液；/nS2、将霍乱弧菌种子液接种至发酵培养基中，培养至菌液的吸光度值在600nm为4.5～5.5时，加入阿拉伯糖进行诱导；/nS3、诱导培养1～3h后，再次加入阿拉伯糖进行二次诱导；/nS4、在诱导阶段，当检测到溶氧值突然下降时，添加卡那霉素，继续培养0.5～1.5h后活菌数目为0；/nS5、诱导培养4～6h后，菌影形成率达到99％以上。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效制备霍乱弧菌菌影的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、挑取霍乱弧菌工程菌株的单菌落，接种至种子培养基中，培养8～14h，获得霍乱弧菌种子液；
S2、将霍乱弧菌种子液接种至发酵培养基中，培养至菌液的吸光度值在600nm为4.5～5.5时，加入阿拉伯糖进行诱导；
S3、诱导培养1～3h后，再次加入阿拉伯糖进行二次诱导；
S4、在诱导阶段，当检测到溶氧值突然下降时，添加卡那霉素，继续培养0.5～1.5h后活菌数目为0；
S5、诱导培养4～6h后，菌影形成率达到99％以上。


2.如权利要求1所述高效制备霍乱弧菌菌影的方法，其特征在于，在所述诱导培养的同时，按照1.0mL/min的补加速率补加营养物质与抗生素，所述营养物质与抗生素包括：甘油5.0～8.0mL/L、酵母粉50～80g/L和氨苄霉素150～250mg/L。


3.如权利要求1所述高效制备霍乱弧菌菌影的方法，其特征在于，所述诱导阶段的pH值维持在7.30～7.50，溶氧水平控制在20～30％，温度控制在28～30℃。


4.如权利要求1所述高效制备霍乱弧菌菌影的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述霍乱弧菌种子液的接种量按5％～10％进行。


5.如权利要求1所述高效制备霍乱弧菌菌影的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述培养是在33～35℃、溶氧水平20～30％、pH值7.30～7.50的条件下，培养时间为5～8h；所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖2.0～8.0g/L、酵母粉2.0～10.0g/L、蛋白胨1.0～5.0g/L、柠檬酸1.0～2.0g/L、KCl1.0～3.0g/L、MgSO4·7H2O1.0～3.0g/L、(NH4)2SO41....

【专利技术属性】
技术研发人员：程立坤，赵修报，沈志强，赵群，张莎莎，林初文，何诚，姜忠兴，付强，李增亮，
申请(专利权)人：山东省滨州畜牧兽医研究院，山东绿都生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37