幽门螺杆菌敏感、快速培养菌落形成及其效能评价方法技术

本发明专利技术公开了幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)敏感、快速培养菌落形成及其效能评价方法。本发明专利技术提供的菌落培养方法包括初次分离、冷冻保存复活、单个菌落生长及传代。该方法具有初次分离和传代培养相同的良好效能。本发明专利技术还提供幽门螺杆菌培养效能评价方法。本发明专利技术为幽门螺杆菌的快速、高效地分离培养传代提供有力工具，同时为幽门螺杆菌培养方法提供效能评价指标。

【技术实现步骤摘要】
幽门螺杆菌敏感、快速培养菌落形成及其效能评价方法
本专利技术涉及微生物培养技术，具体地说，涉及幽门螺杆菌敏感、快速培养菌落形成及其效能评价方法。
技术介绍
幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)是微需氧、能在人类胃肠粘膜持续定植并引起各种胃炎、十二指肠球炎和消化性溃疡最常见的致病菌，也和胃癌、胃MALT淋巴瘤密切相关，幽门螺杆菌感染率可达50％以上；并且和胃肠外感染疾病也有相关，如肺炎、菌血症、血清糖化血红蛋白水平相关等。因此诊断幽门螺杆菌感染很有必要。诊断幽门螺杆菌感染有多种技术，分为过筛试验和确诊试验。过筛试验包括脲酶试验、病理组织形态学检查、UBT试验、血清抗体、粪便抗原和分子生物学技术等；确诊试验只有幽门螺杆菌分离培养和免疫组化技术，幽门螺杆菌分离培养是所有诊断技术最特异的方法。常规病理形态学诊断并不能排除和幽门螺杆菌相似的弯曲菌和其它螺杆菌定植或感染。由于胃内有脲酶阳性的其它细菌存在，UBT和脲酶试验会产生假阳性结果，血清抗体可能反映继往感染，粪便抗原敏感性较差，分子生物学技术要求高，并且这些技术都不能提供可靠的药敏试验结果。幽门螺杆菌分离培养是这些诊断方法的“金标准”，并且是表型药敏试验和基因分型的必须过程。为了预防和治疗幽门螺杆菌感染引起的疾病，进行幽门螺杆菌快速分离培养有重要意义。培养分为初次分离(primaryisolation)和传代培养(subculture)。菌落形成包括从人体标本初次分离菌落形成和传代培养的菌落形成。初次分离是将包含幽门螺杆菌活细胞的组织标本接种在合适的分离培养基(primaryculture)并使其细胞生长尽可能多的菌落。传代培养是将幽门螺杆菌培养物接种在传代培养基并使其良好生长。分离培养基和传代培养基应该不同，组织标本通常含有除幽门螺杆菌之外的杂菌，需要在分离培养基添加抑制杂菌生长的抗生素而不影响幽门螺杆菌生长。传代培养基不需要添加抗生素，其他成分也可以与分离培养基不同，主要用于幽门螺杆菌生物学特征分析、表型药敏试验等试验。传代培养包括在平板培养基上菌落和冷冻保存培养物复活的菌落生长。传代培养复活率受培养基成分、稳定性等因素影响。影响幽门螺杆菌初次分离结果有二个重要因素：分离复活率(Recoveryrates)和分离时间。分离复活率决定于分离敏感性，受很多因素影响，包括患者是否使用抗生素等治疗、取材部位和数量、取材和处理标本方式及过程、运送培养基、分离培养基和分离培养条件等，致使初次分离培养敏感性变化较大(60–90％)。分离培养基抑制胃肠粘膜杂菌生长的效能，也会影响幽门螺杆菌分离复活率。尽管培养幽门螺杆菌有很多培养基，但快速、敏感的分离方法还未见报道。应用Columbia琼脂马血培养基从胃粘膜组织标本分离幽门螺杆菌2-10天，应用GC琼脂培养基分离幽门螺杆菌4-10天。快速分离培养的本质就是将含有幽门螺杆菌可培养的活细胞标本在合适的培养基上快速生长形成幽门螺杆菌菌落。幽门螺杆菌分离培养的影响因素和分离培养基密切相关。另一个重要问题是，幽门螺杆菌初次分离成功后，但传代培养失败，致使药敏试验等无法完成。有文献报道传代培养存活率(药敏完成率)只有84.8％，这说明幽门螺杆菌传代培养方法也存在重大缺陷。关于应用初次分离培养基作为传代培养基进行培养，从而敏感、快速形成幽门螺杆菌菌落还没有文献报道，对于幽门螺杆菌敏感、快速分离培养菌落形成方法也没有效能评价方法，培养基效能应满足公式：初次分离培养基＝传代培养基。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种幽门螺杆菌敏感、快速培养菌落形成方法，该方法具有初次分离和传代培养相同的良好效能。本专利技术的另一目的是提供幽门螺杆菌培养效能评价方法，提供其效能评价指标。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供的幽门螺杆菌敏感、快速培养菌落形成方法，包括以下步骤：I、初次分离步骤1：打开谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏、保存试剂盒(海南省临床微生物学检测与研究中心生产)，取出谷氏幽门螺杆菌快速培养平板，进行真空密封包装，并在防水、避光条件下保存；步骤2：取2枚粒径为3-6mm的锆珠，放入1-2mLEP管内，进行灭菌；步骤3：打开谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏、保存试剂盒，取0.5-1.0mL谷氏幽门螺杆菌保存培养基，放入上述灭菌的EP管内；步骤4：疑为幽门螺杆菌感染者要求至少20天内未使用PPI和抗生素进行治疗，进行胃肠组织取样，将组织样本放入步骤3的EP管内，完全浸入培养基内，盖紧瓶盖后，放入2-8℃保存，保存期不超过10天；使用内窥镜进行胃肠组织取样，如果胃肠组织存在异常(溃疡、糜烂或肿块等)须在正常组织与异常组织交界处优先取样；步骤5：将含有组织样本的谷氏幽门螺杆菌保存培养基用组织研磨器进行研磨1-2min；步骤6：打开真空密封包装，取出1块谷氏幽门螺杆菌快速培养平板，吸取100-200μL研磨的标本接种在谷氏幽门螺杆菌快速培养平板上，在无菌条件下接种，接种的局部温度低于40℃；在微需氧和湿度100％的条件下，35-37℃培养48-120h，观察菌落形态，典型菌落形态为紫色、圆形菌落或可出现弥漫菌落形态；II、冷冻保存复活步骤7：将幽门螺杆菌液态样本于-70～-80℃冷冻保存，解冻后吸取100-200μL样本，并按照步骤6的方法进行复活培养；III、单个菌落生长步骤8：将幽门螺杆菌菌落用无菌生理盐水调配1.0麦氏浊度菌液，连续倍比稀释至第13梯度以上；打开真空密封包装，取出2块谷氏幽门螺杆菌快速培养平板，在其背面中心划线，均等分成2个区域；取稀释菌液(如16梯度)20μL分别接种在平板划线培养基区域内，用无菌接种环进行连续密集划圆涂布；然后按照步骤6的方法培养48-96h，观察培养基平板上的单个菌落生长情况；III、单个菌落传代步骤9：打开真空密封包装，取出1块谷氏幽门螺杆菌快速培养平板，在其背面中心划十字线，均等分成4个或8个区域。用无菌接种环刮取单个菌落在平板上一个区域内进行连续密集划圆涂布，直径13-17mm；每块平板可以纯化4株菌或8株菌；无菌接种，接种的局部温度低于40℃；在微需氧和湿度100％的条件下，35-37℃培养24h，观察菌落形态。本专利技术中，微需氧条件是指：3-6％O2、5-10％CO2、5-10％H2和76-86％N2。优选地，培养的温度条件为：37℃，微需氧条件为：5％O2、10％CO2、5％H2和80％N2，或者，5％O2、7.6％CO2、7.6％H2和79.8％N2。前述的方法，对培养平板进行真空密封包装，满足防水、避光条件。前述的方法，在无菌条件接种的局部温度低于40℃。前述的方法，保存培养基内含有锆珠。前述的方法，标本尽快放入含有锆珠的EP管内，完全浸入培养基内，盖紧瓶盖后，放入2-8℃保存。前述的方法，含有锆珠的EP管标本，进行研磨1-2min。前述的方法，单个菌落生长是将幽门螺杆菌菌落用生理盐水调配1.0麦氏浊度菌液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)敏感、快速培养菌落形成方法，其特征在于，包括以下步骤：/nI、初次分离/n步骤1：打开谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏、保存试剂盒，取出谷氏幽门螺杆菌快速培养平板，进行真空密封包装，并在防水、避光条件下保存；/n步骤2：取2枚粒径为3-6mm的锆珠，放入1-2mL EP管内，进行灭菌；/n步骤3：打开谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏、保存试剂盒，取0.5-1.0mL谷氏幽门螺杆菌保存培养基，放入上述灭菌的EP管内；/n步骤4：疑为幽门螺杆菌感染者要求至少20天内未使用PPI和抗生素进行治疗，进行胃肠组织取样，将组织样本放入步骤3的EP管内，完全浸入培养基内，盖紧瓶盖后，放入2-8℃保存，保存期不超过10天；/n步骤5：将含有组织样本的谷氏幽门螺杆菌保存培养基用组织研磨器进行研磨1-2min；/n步骤6：打开真空密封包装，取出1块谷氏幽门螺杆菌快速培养平板，吸取100-200μL研磨的标本接种在谷氏幽门螺杆菌快速培养平板上，在无菌条件下接种，接种的局部温度低于40℃；在微需氧和湿度100％的条件下，35-37℃培养48-120h，观察菌落形态，典型菌落形态为紫色、圆形菌落或可出现弥漫菌落形态；/nII、冷冻保存复活/n步骤7：将幽门螺杆菌液态样本于-70～-80℃冷冻保存，解冻后吸取100-200μL样本，并按照步骤6的方法进行复活培养；/nIII、单个菌落生长/n步骤8：将幽门螺杆菌菌落用无菌生理盐水调配1.0麦氏浊度菌液，连续倍比稀释至第13梯度以上；打开真空密封包装，取出2块谷氏幽门螺杆菌快速培养平板，在其背面中心划线，均等分成2个区域；取稀释菌液20μL分别接种在平板划线培养基区域内，用无菌接种环进行连续密集划圆涂布；然后按照步骤6的方法培养48-96h，观察培养基平板上的单个菌落生长情况；/nIII、单个菌落传代/n步骤9：打开真空密封包装，取出1块谷氏幽门螺杆菌快速培养平板，在其背面中心划十字线，均等分成4个或8个区域；用无菌接种环刮取单个菌落在平板上一个区域内进行连续密集划圆涂布，直径13-17mm；接种的局部温度低于40℃；在微需氧和湿度100％的条件下，35-37℃培养24h，观察菌落形态；/n其中，微需氧条件是指：3-6％O...

【技术特征摘要】
1.幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)敏感、快速培养菌落形成方法，其特征在于，包括以下步骤：
I、初次分离
步骤1：打开谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏、保存试剂盒，取出谷氏幽门螺杆菌快速培养平板，进行真空密封包装，并在防水、避光条件下保存；
步骤2：取2枚粒径为3-6mm的锆珠，放入1-2mLEP管内，进行灭菌；
步骤3：打开谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏、保存试剂盒，取0.5-1.0mL谷氏幽门螺杆菌保存培养基，放入上述灭菌的EP管内；
步骤4：疑为幽门螺杆菌感染者要求至少20天内未使用PPI和抗生素进行治疗，进行胃肠组织取样，将组织样本放入步骤3的EP管内，完全浸入培养基内，盖紧瓶盖后，放入2-8℃保存，保存期不超过10天；
步骤5：将含有组织样本的谷氏幽门螺杆菌保存培养基用组织研磨器进行研磨1-2min；
步骤6：打开真空密封包装，取出1块谷氏幽门螺杆菌快速培养平板，吸取100-200μL研磨的标本接种在谷氏幽门螺杆菌快速培养平板上，在无菌条件下接种，接种的局部温度低于40℃；在微需氧和湿度100％的条件下，35-37℃培养48-120h，观察菌落形态，典型菌落形态为紫色、圆形菌落或可出现弥漫菌落形态；
II、冷冻保存复活
步骤7：将幽门螺杆菌液态样本于-70～-80℃冷冻保存，解冻后吸取100-200μL样本，并按照步骤6的方法进行复活培养；
III、单个菌落生长
步骤8：将幽门螺杆菌菌落用无菌生理盐水调配1.0麦氏浊度菌液，连续倍比稀释至第13梯度以上；打开真空密封包装，取出2块谷氏幽门螺杆菌快速培养平板，在其背面中心划线，均等分成2个区域；取稀释菌液20μL分别接种在平板划线培养基区域内，用无菌接种环进行连续密集划圆涂布；然后按照步骤6的方法培养48-96h，观察培养基平板上的单个菌落生长情况；
III、单个菌落传代
步骤9：打开真空密封包装，取出1块谷氏幽门螺杆菌快速培养平板，在其背面中心划十字线，均等分成4个或8个区域；用无菌接种环刮取单个菌落在平板上一个区域内进行连续密集划圆涂布，直径13-17mm；接种的局部温度低于40℃；在微需氧和湿度100％的条件下，35-37℃培养24h，观察菌落形态；
其中，微需氧条件是指：3-6％O2、5-10％CO2、5-10％H2和76-86％N2。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对培养平板进行真空密封包装，满足防水、避光条件。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，培养的温度条件为：37℃，微需氧条件为：5％O2、10％CO2、5％H2和80％N2，或者，5％O2、7.6％CO2、7.6％H2和79.8％N2。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在无菌条件接种的局部温度低于40℃。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，保存培养基内含有锆珠。


6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，标本尽快放入含有锆珠的EP管内，完全浸入培养基内，盖紧瓶盖后，放入2-8℃保存。


7.根据权利要求1-6所述的方法，其特征在于，含有锆珠的EP管标本，进行研磨1-2min。


8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，单个菌落生长是将幽门螺杆菌菌落用生理盐水调配1.0麦氏浊度菌液，连续倍比稀释至第13梯度以上。


9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，单个菌落传代用无菌接种环刮取单个菌落在平板上一个区域内进行连续密集划圆涂布微需氧培养24h。


10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在胃肠组织存在异常的情况下，在正常组织与异常组织交界处进行取样；
其中，胃肠组织存在异常包括炎症、溃疡、糜烂或肿块。


11.幽门螺杆菌培养效能评价方法，其特征在于，幽门螺杆菌培养效能评价指标包括抑杂菌率、菌株分离率、菌株传代存活率、冷冻保存菌株传代复活率、室温保存菌落传代存活率、菌落生长灵敏度、不同培养时间菌落数量比、单个菌落传代细胞生长量以及混合菌落细胞生长量。


12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，当评价指标为抑杂菌率时，评价方法包括：
1)在血琼脂平板上分别接种大肠埃希氏菌ATCC25922和金黄葡萄球菌ATCC25923，37℃培养16-18h，将培养好的大肠埃希氏菌ATCC25922、金黄葡萄球菌ATCC25923用无菌生理盐水分别配制1.0麦氏浊度菌液，连续倍比稀释至17梯度，取10μL稀释后的菌液分别接种于血琼脂平板上，37℃培养24h，在平板上形成的菌落数分别记为CN1、CN2；
2)在沙保弱氏培养基平板上接种白色念珠菌ATCC90028，37℃培养16-18h，将培养好的白色念珠菌ATCC90028用...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷海瀛，
申请(专利权)人：海南省临床微生物学检测与研究中心，谷海瀛，
类型：发明
国别省市：海南;46