一株产烟酰胺单核苷酸的成都肠杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一株产烟酰胺单核苷酸的成都肠杆菌及其应用，涉及菌株的筛选与应用技术领域。本发明专利技术所述成都肠杆菌从生产NMN相关产品的工厂的下水道附近采集土壤，通过初筛，复筛，挑选出土壤中转化烟酰胺生成烟酰胺单核苷酸能力强的菌株，并对其进行鉴定与保藏，经测定所述肠杆菌为革兰氏阴性菌，属于成都肠杆菌属。以烟酰胺为底物利用所述成都肠杆菌在发酵生产NMN时，15min时NMN产量能达到67.66μM，即22.6mg/L，表明该野生菌株具有很强的合成NMN的活性，降低了合成NMN时对Nampt的依赖性，具有较高的规模化应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一株产烟酰胺单核苷酸的成都肠杆菌及其应用
本专利技术属于菌株的筛选与应用
，具体涉及一株产烟酰胺单核苷酸的成都肠杆菌及其应用。
技术介绍
烟酰胺单核苷酸(NicotinamideMononucleotide，NMN)是一种有机分子，也是一种核苷酸，具有逆转衰老和延长寿命的作用。目前，多采用酶促反应来实现烟酰胺单核苷酸的大规模合成，但是酶促反应成本高昂，反应条件苛刻，生产工艺不稳定，每个批次产品指标相差大，反应产能低；近些年也有通过生物手段发酵生产NMN的方法，但是天然烟酰胺磷酸核糖转移酶(NiaciNamidephosphoribosyltransferase，Nampt)存在酶活性较低的问题，且催化耗时长、成本高、收率低，难以实现工厂化大规模生产，限制了NMN的大规模应用。为此，中国专利CN201811606780.9中公开了一种利用重组大肠杆菌发酵NMN的方法，但是转基因重组菌株成本较高，且生物安全性存疑，尤其是将其应用到化妆品、食品或药品中时。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一株产烟酰胺单核苷酸且具有高生产活性的成都肠杆菌及其应用，所述成都肠杆菌可催化烟酰胺(nicotinamide，Nam)生成NMN，为后续的工业化生产奠定基础。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一株产烟酰胺单核苷酸的成都肠杆菌(Enterobacterchengduensis)2021T4.7，所述成都肠杆菌2021T4.7的生物保藏编号为CGMCCNo.21695。优选的，所述成都肠杆菌2021T4.7的16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了上述成都肠杆菌2021T4.7在生产烟酰胺单核苷酸中的应用。本专利技术还提供了一种利用上述成都肠杆菌2021T4.7生产烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以烟酰胺为诱导物，将所述成都肠杆菌2021T4.7在发酵培养基中进行发酵富集，发酵后先离心再用PBS缓冲液重悬，得到菌液；所述发酵培养基包括以下质量百分含量的组分：葡萄糖0.25％～1.5％、胰蛋白胨0.25％～1.5％、KH2PO40～1.5％和MgSO4·7H2O0～0.15％，pH值为5～10；(2)以烟酰胺为底物，利用步骤(1)得到的菌液进行发酵反应，得烟酰胺单核苷酸。优选的，步骤(1)中诱导物烟酰胺的质量百分含量为0～1.25％。优选的，步骤(1)中发酵培养基的pH值为7.0。优选的，步骤(1)中所述发酵富集的温度为25～40℃，时间为12～24h。优选的，进行步骤(2)所述发酵反应时还包括母液，所述母液与菌液的体积比为1:1；所述母液包括以下浓度的组分：50mMTris-Hcl缓冲液、质量浓度为0.02％BSA、12mMMgCl2、2mMATP、2mMDTT和40μMprpp。优选的，步骤(2)中底物烟酰胺的浓度为100～1000μM。优选的，步骤(2)所述发酵反应的温度为37℃，时间为15min。本专利技术提供了一株产烟酰胺单核苷酸的成都肠杆菌2021T4.7，从生产NMN相关产品的工厂的下水道附近采集土壤，通过初筛，复筛，挑选出土壤中转化烟酰胺生成烟酰胺单核苷酸能力强的菌株，并对其进行鉴定与保藏，经测定所述成都肠杆菌2021T4.7为革兰氏阴性菌，属于成都肠杆菌属。以烟酰胺为底物利用所述成都肠杆菌2021T4.7在发酵生产NMN时，15min时NMN产量能达到67.66μM，即22.6mg/L，表明该野生菌株具有很强的合成NMN的活性，能提供Nampt的同工酶，降低了合成NMN时对Nampt的依赖性。本专利技术所述肠杆菌为野生菌，相比于利用重组菌发酵NMN，成本更低，生物安全性更高。生物保藏信息成都肠杆菌(Enterobacterchengduensis)2021T4.7，于2021年01月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.21695。附图说明图1为NMN浓度与荧光度标准曲线；图2为肠杆菌菌体形态图；图3为肠杆菌经革兰氏染色后染色结果；图4为步骤(1)发酵培养基中葡萄糖含量优化对NMN产量影响图；图5为步骤(1)发酵培养基中胰蛋白胨含量优化对NMN产量影响图；图6为步骤(1)发酵培养基中KH2PO4含量优化对NMN产量影响图；图7为步骤(1)发酵培养基中MgSO4·7H2O含量优化对NMN产量影响图；图8为步骤(1)诱导物烟酰胺含量优化对NMN产量影响图；图9为步骤(1)发酵培养基初始pH值优化对NMN产量影响图；图10为步骤(1)发酵富集温度优化对NMN产量影响图；图11为步骤(1)发酵富集时间优化对NMN产量影响图；图12为在步骤(1)发酵富集最优条件时步骤(2)底物烟酰胺含量优化对NMN产量影响图。具体实施方式本专利技术提供了一株产烟酰胺单核苷酸的成都肠杆菌(Enterobacterchengduensis)2021T4.7，所述成都肠杆菌2021T4.7的生物保藏编号为CGMCCNo.21695。本专利技术所述成都肠杆菌2021T4.7为革兰氏阴性菌，16SrDNA序列优选如SEQIDNO.1所示：TTACTGGGCGTAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株产烟酰胺单核苷酸的成都肠杆菌(Enterobacter chengduensis)2021T4.7，其特征在于，所述成都肠杆菌2021T4.7的生物保藏编号为CGMCC No.21695。/n

【技术特征摘要】
1.一株产烟酰胺单核苷酸的成都肠杆菌(Enterobacterchengduensis)2021T4.7，其特征在于，所述成都肠杆菌2021T4.7的生物保藏编号为CGMCCNo.21695。


2.根据权利要求1所述成都肠杆菌2021T4.7，其特征在于，所述成都肠杆菌2021T4.7的16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示。


3.权利要求1或2所述成都肠杆菌2021T4.7在生产烟酰胺单核苷酸中的应用。


4.一种利用权利要求1或2所述成都肠杆菌2021T4.7生产烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以烟酰胺为诱导物，将所述成都肠杆菌2021T4.7在发酵培养基中进行发酵富集，发酵后先离心再用PBS缓冲液重悬，得到菌液；所述发酵培养基包括以下质量百分含量的组分：葡萄糖0.25％～1.5％、胰蛋白胨0.25％～1.5％、KH2PO40～1.5％和MgSO4·7H2O0～0.15％，pH值为5～10；
(2)以烟酰胺为底物，利...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵丽青，陈建生，段志刚，张海潮，
申请(专利权)人：泓博元生命科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44