一种产细菌素菌株的分离筛选和检测鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种产细菌素菌株的分离筛选和检测鉴定方法，包括以下操作步骤：产细菌素菌株的发酵肉样品的筛选：发酵肉制品是产细菌素菌株的重要来源之一，在无菌环境下，将肉制品样品切碎并置于绞肉机中绞碎，取样品加到无菌生理盐水的三角瓶中，充分震荡，静置后取悬液加到MRS液体培养基中。本发明专利技术所述的一种产细菌素菌株的分离筛选和检测鉴定方法，通过管碟法对采集的样品进行抑菌实验的检测，将此样品作为产细菌素菌株筛选以及关于细菌素后续研究的对象展开后续实验，从宏观方面来筛选，即首先筛选含有产细菌素乳酸菌的样品，再分离产细菌素的菌株，这样有目的性的分离筛选将提高效率，缩短菌株筛选的周期，带来更好的使用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种产细菌素菌株的分离筛选和检测鉴定方法
本专利技术涉及产细菌素菌株鉴定领域，特别涉及一种产细菌素菌株的分离筛选和检测鉴定方法。
技术介绍
产细菌素的菌株主要存在于发酵肉制品、乳制品等多种食品中。其中，发酵肉制品是产细菌素菌株的重要来源之一。该细菌素普遍具有安全性高、抑菌专一性强、pH稳定性和热稳定性高等优势，随着科技的不断发展，人们对于产细菌素菌株的分离筛选和检测鉴定方法要求也越来越高。现有的产细菌素菌株的分离筛选和检测鉴定方法在使用时存在一定的弊端，传统产细菌素乳酸菌的筛选都是先从样品中筛选得到乳酸菌，再通过检测乳酸菌的发酵上清的抑菌活性来判断是否具有产细菌素的能力，降低工作效率，不利于人们的使用，给人们的使用过程带来了一定的不利影响，为此，我们提出一种产细菌素菌株的分离筛选和检测鉴定方法。
技术实现思路
(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种产细菌素菌株的分离筛选和检测鉴定方法，通过管碟法对采集的样品进行抑菌实验的检测，将此样品作为产细菌素菌株筛选以及关于细菌素后续研究的对象展开后续实验，从宏观方面来筛选，即首先筛选含有产细菌素乳酸菌的样品，再分离产细菌素的菌株，这样有目的性的分离筛选将提高效率，缩短菌株筛选的周期，可以有效解决
技术介绍
中的问题。(二)技术方案为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种产细菌素菌株的分离筛选和检测鉴定方法，包括以下操作步骤：S1：产细菌素菌株的发酵肉样品的筛选：发酵肉制品是产细菌素菌株的重要来源之一，在无菌环境下，将肉制品样品切碎并置于绞肉机中绞碎，取样品加到无菌生理盐水的三角瓶中，充分震荡，静置后取悬液加到MRS液体培养基中，置于恒温培养箱中，将培养好的菌液离心去沉淀，用L-1NaOH溶液将上清调至pH6.0左右，用管碟法抑菌实验检验上清有否有抑菌效果；S2：产细菌素菌株的样品中乳酸菌的分离纯化：在无菌环境下，将含产细菌素菌株的肉制品切碎并置于绞肉机中绞碎，取样品加到含有无菌生理盐水的三角瓶中，充分震荡，静置后即为YS01的悬液，另取装有9mL无菌水试管5支，吸取已稀释成YS01的悬液1mL加入无菌生理水的试管中，并震荡使之充分混匀，即成10-2稀释液，同法依次10倍连续稀释至10-4、10-5、10-6、10-7，取各个梯度的稀释液1mL至无菌平皿中，取已熔化的MRS固体培养基倒入平皿中，凝固后，倒置恒温培养，平板培养后，根据菌落形态、大小、颜色、培养基中生长位置，表面、内部、及底部，用接种环挑取不同表观特征菌落接种于MRS液体培养基中，置于恒温培养箱中培养，将培养好的菌株以10倍系列梯度稀释，选择合适的稀释度，取1mL菌液加入平皿中，用含有碳酸钙的MRS培养基倒平板，凝固后，倒置恒温培养，挑取具有溶钙圈的菌落进行接种培养，并用革兰氏染色进行镜检，记录存档，用甘油脱脂乳将纯化好的乳酸菌保藏于-20℃，以待后续实验所用；S3：产细菌素乳酸菌的初筛：将S2步骤中分离出来的乳酸菌菌株进行活化，按1％的接种量将其接种于MRS液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养12-16h，再以同样的方法活化第二代，之后接种第三代并于37℃培养箱中培养24h，将培养好的菌液进行离心，并去上菌体沉淀，用L-1NaOH溶液将上清调至pH6.0左右，用S1步骤中所述管碟法检测乳酸菌株的发酵上清是否具有抑菌活性；S4：产细菌素乳酸菌的复筛：为排除抑菌物质为酸和H2O2的可能，并确定抑菌物质为蛋白质，将S3步骤中有效果的菌株以同样的方法活化获得发酵上清后，进行酸作用排除实验、H2O2作用排除实验与抑菌物质为蛋白质的确定实验；S5：产细菌素菌株的RAPD分析：对产细菌素菌株的DNA进行提取，将筛选出来的产细菌素的菌株进行活化，基于传统法进行部分条件优化后提取DNA，从实验室已有的7种随机引物中筛选适合的引物：P1252、P1284、OPA-18、OPL-16、OPM-05、OPA-03、OPV-07，淘汰扩增效果较差，条带模糊不清的引物，对扩增总条带数多于5条且条带清晰的引物用于再次筛选，从扩增后的电泳图中选用多态性和扩增重复性好，谱带清晰且较多的引物，用于产细菌素菌株DNA样品的RAPD分析；S6：产细菌素菌株的形态学及生理生化鉴定：主要分为培养特征鉴定、形态特征鉴定与生理生化特征鉴定；S7：产细菌素菌株的16SrDNA鉴定：将S5步骤中提取好的目标菌株基因组DNA进行16SrDNA的PCR扩增，16SrDNA的PCR扩增反应中所用引物为通用引物，采用PCR对目的片段进行扩增，同时设置空白对照组，即用ddH2O代替扩增体系中的DNA模板，PCR结束后将PCR扩增产物置于4℃保存，取PCR扩增产物与溴酚兰混匀后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，确定出现单一条带，对其进切胶回收纯化，测序，将测序所得结果于NCBI上进行BLAST比对，并利用对得出的结果构建系统发育树；S8：产细菌素菌株的毒力检测：为了评估菌的潜在致病性，对其是否含一些毒力基因进行检测，方法是对这些毒力基因进行PCR，需要检测的毒力基因包括asa1，即聚集物、ace，即胶原蛋白黏附素、esp，即肠球菌表面蛋白、efaAfm，即细胞壁黏附素、cylA/B，即细胞溶素的活化和表达，其中不同引物的退火温度不同，实验中按照各自引物的退火温度设置PCR程序，PCR结束后将PCR扩增产物置于4℃保存，取PCR扩增产物与溴酚兰混匀后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，在自动凝胶成像仪中观察、拍照记录。作为一种优选的技术方案，所述的常用培养基的配制主要包括MRS培养基及BHI培养基。作为一种优选的技术方案，所述的常用试剂及缓冲液主要包括生理盐水：0.85％NaCl溶液、甘油脂脱乳：用12％灭菌脱脂乳将甘油稀释至20％-30％、Tris-SDS：6.06gTris-碱与2.1mL浓HCl混合，然后加入40mL蒸馏水和40mL0.5M的EDTA，然后冷却至室温，调pH至9.0，最后定容至250mL后，加50mL10％的SDS、SDS、酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇、异丙醇、氯仿、溴酚兰、EDTA、TE饱和酚、EB、乙酸钠，琼脂糖等。作为一种优选的技术方案，所述的实验样品通过保质期、是否发酵及热处理强度这三方面对实验样品进行筛选，优先选择保质期长、通过发酵及热处理强度较低的产品，最终确定了不同种类的发酵肉制品，贮藏于4℃待用。作为一种优选的技术方案，所述S1步骤中上清抑菌活性的测定一般采用双层琼脂培养的管碟法，在无菌环境下，取水琼脂倾注于平皿中，静置，待其凝固后，吸取指示菌单增李斯特氏菌加到已熔化的BHI固体培养基中，在漩涡振荡器上充分混匀，并趁热倾注于平皿中，待其凝固后，在超净台中将平皿盖打开，在无菌环境下让水分挥发20min，之后将牛津杯轻放于凝固的培养基上，取发酵上清加入牛津杯中，将平皿放置于4℃冰箱6-12h后，正置恒温培养，培养温度37℃，培养时间12-16h，检测是否出现抑菌圈并记录抑菌圈的直径大小。作为一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产细菌素菌株的分离筛选和检测鉴定方法，其特征在于：包括以下操作步骤：/nS1：产细菌素菌株的发酵肉样品的筛选：发酵肉制品是产细菌素菌株的重要来源之一，在无菌环境下，将肉制品样品切碎并置于绞肉机中绞碎，取样品加到无菌生理盐水的三角瓶中，充分震荡，静置后取悬液加到MRS液体培养基中，置于恒温培养箱中，将培养好的菌液离心去沉淀，用L-1NaOH溶液将上清调至pH 6.0左右，用管碟法抑菌实验检验上清有否有抑菌效果；/nS2：产细菌素菌株的样品中乳酸菌的分离纯化：在无菌环境下，将含产细菌素菌株的肉制品切碎并置于绞肉机中绞碎，取样品加到含有无菌生理盐水的三角瓶中，充分震荡，静置后即为YS01的悬液，另取装有9mL无菌水试管5支，吸取已稀释成YS01的悬液1mL加入无菌生理水的试管中，并震荡使之充分混匀，即成10-2稀释液，同法依次10倍连续稀释至10-4、10-5、10-6、10-7，取各个梯度的稀释液1mL至无菌平皿中，取已熔化的MRS固体培养基倒入平皿中，凝固后，倒置恒温培养，平板培养后，根据菌落形态、大小、颜色、培养基中生长位置，表面、内部、及底部，用接种环挑取不同表观特征菌落接种于MRS液体培养基中，置于恒温培养箱中培养，将培养好的菌株以10倍系列梯度稀释，选择合适的稀释度，取1mL菌液加入平皿中，用含有碳酸钙的MRS培养基倒平板，凝固后，倒置恒温培养，挑取具有溶钙圈的菌落进行接种培养，并用革兰氏染色进行镜检，记录存档，用甘油脱脂乳将纯化好的乳酸菌保藏于-20℃，以待后续实验所用；/nS3：产细菌素乳酸菌的初筛：将S2步骤中分离出来的乳酸菌菌株进行活化，按1％的接种量将其接种于MRS液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养12-16h，再以同样的方法活化第二代，之后接种第三代并于37℃培养箱中培养24h，将培养好的菌液进行离心，并去上菌体沉淀，用L-1NaOH溶液将上清调至pH6.0左右，用S1步骤中所述管碟法检测乳酸菌株的发酵上清是否具有抑菌活性；/nS4：产细菌素乳酸菌的复筛：为排除抑菌物质为酸和H2O2的可能，并确定抑菌物质为蛋白质，将S3步骤中有效果的菌株以同样的方法活化获得发酵上清后，进行酸作用排除实验、H2O2作用排除实验与抑菌物质为蛋白质的确定实验；/nS5：产细菌素菌株的RAPD分析：对产细菌素菌株的DNA进行提取，将筛选出来的产细菌素的菌株进行活化，基于传统法进行部分条件优化后提取DNA，从实验室已有的7种随机引物中筛选适合的引物：P1252、P1284、OPA-18、OPL-16、OPM-05、OPA-03、OPV-07，淘汰扩增效果较差，条带模糊不清的引物，对扩增总条带数多于5条且条带清晰的引物用于再次筛选，从扩增后的电泳图中选用多态性和扩增重复性好，谱带清晰且较多的引物，用于产细菌素菌株DNA样品的RAPD分析；/nS6：产细菌素菌株的形态学及生理生化鉴定：主要分为培养特征鉴定、形态特征鉴定与生理生化特征鉴定；/nS7：产细菌素菌株的16S rDNA鉴定：将S5步骤中提取好的目标菌株基因组DNA进行16SrDNA的PCR扩增，16SrDNA的PCR扩增反应中所用引物为通用引物，采用PCR对目的片段进行扩增，同时设置空白对照组，即用ddH2O代替扩增体系中的DNA模板，PCR结束后将PCR扩增产物置于4℃保存，取PCR扩增产物与溴酚兰混匀后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，确定出现单一条带，对其进切胶回收纯化，测序，将测序所得结果于NCBI上进行BLAST比对，并利用对得出的结果构建系统发育树；/nS8：产细菌素菌株的毒力检测：为了评估菌的潜在致病性，对其是否含一些毒力基因进行检测，方法是对这些毒力基因进行PCR，需要检测的毒力基因包括asa1，即聚集物、ace，即胶原蛋白黏附素、esp，即肠球菌表面蛋白、efaAfm，即细胞壁黏附素、cylA/B，即细胞溶素的活化和表达，其中不同引物的退火温度不同，实验中按照各自引物的退火温度设置PCR程序，PCR结束后将PCR扩增产物置于4℃保存，取PCR扩增产物与溴酚兰混匀后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，在自动凝胶成像仪中观察、拍照记录。/n...

【技术特征摘要】
1.一种产细菌素菌株的分离筛选和检测鉴定方法，其特征在于：包括以下操作步骤：
S1：产细菌素菌株的发酵肉样品的筛选：发酵肉制品是产细菌素菌株的重要来源之一，在无菌环境下，将肉制品样品切碎并置于绞肉机中绞碎，取样品加到无菌生理盐水的三角瓶中，充分震荡，静置后取悬液加到MRS液体培养基中，置于恒温培养箱中，将培养好的菌液离心去沉淀，用L-1NaOH溶液将上清调至pH6.0左右，用管碟法抑菌实验检验上清有否有抑菌效果；
S2：产细菌素菌株的样品中乳酸菌的分离纯化：在无菌环境下，将含产细菌素菌株的肉制品切碎并置于绞肉机中绞碎，取样品加到含有无菌生理盐水的三角瓶中，充分震荡，静置后即为YS01的悬液，另取装有9mL无菌水试管5支，吸取已稀释成YS01的悬液1mL加入无菌生理水的试管中，并震荡使之充分混匀，即成10-2稀释液，同法依次10倍连续稀释至10-4、10-5、10-6、10-7，取各个梯度的稀释液1mL至无菌平皿中，取已熔化的MRS固体培养基倒入平皿中，凝固后，倒置恒温培养，平板培养后，根据菌落形态、大小、颜色、培养基中生长位置，表面、内部、及底部，用接种环挑取不同表观特征菌落接种于MRS液体培养基中，置于恒温培养箱中培养，将培养好的菌株以10倍系列梯度稀释，选择合适的稀释度，取1mL菌液加入平皿中，用含有碳酸钙的MRS培养基倒平板，凝固后，倒置恒温培养，挑取具有溶钙圈的菌落进行接种培养，并用革兰氏染色进行镜检，记录存档，用甘油脱脂乳将纯化好的乳酸菌保藏于-20℃，以待后续实验所用；
S3：产细菌素乳酸菌的初筛：将S2步骤中分离出来的乳酸菌菌株进行活化，按1％的接种量将其接种于MRS液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养12-16h，再以同样的方法活化第二代，之后接种第三代并于37℃培养箱中培养24h，将培养好的菌液进行离心，并去上菌体沉淀，用L-1NaOH溶液将上清调至pH6.0左右，用S1步骤中所述管碟法检测乳酸菌株的发酵上清是否具有抑菌活性；
S4：产细菌素乳酸菌的复筛：为排除抑菌物质为酸和H2O2的可能，并确定抑菌物质为蛋白质，将S3步骤中有效果的菌株以同样的方法活化获得发酵上清后，进行酸作用排除实验、H2O2作用排除实验与抑菌物质为蛋白质的确定实验；
S5：产细菌素菌株的RAPD分析：对产细菌素菌株的DNA进行提取，将筛选出来的产细菌素的菌株进行活化，基于传统法进行部分条件优化后提取DNA，从实验室已有的7种随机引物中筛选适合的引物：P1252、P1284、OPA-18、OPL-16、OPM-05、OPA-03、OPV-07，淘汰扩增效果较差，条带模糊不清的引物，对扩增总条带数多于5条且条带清晰的引物用于再次筛选，从扩增后的电泳图中选用多态性和扩增重复性好，谱带清晰且较多的引物，用于产细菌素菌株DNA样品的RAPD分析；
S6：产细菌素菌株的形态学及生理生化鉴定：主要分为培养特征鉴定、形态特征鉴定与生理生化特征鉴定；
S7：产细菌素菌株的16SrDNA鉴定：将S5步骤中提取好的目标菌株基因组DNA进行16SrDNA的PCR扩增，16SrDNA的PCR扩增反应中所用引物为通用引物，采用PCR对目的片段进行扩增，同时设置空白对照组，即用ddH2O代替扩增体系中的DNA模板，PCR结束后将PCR扩增产物置于4℃保存，取PCR扩增产物与溴酚兰混匀后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，确定出现单一条带，对其进切胶回收纯化，测序，将测序所得结果于NCBI上进行BLAST比对，并利用对得出的结果构建系统发育树；
S8：产细菌素菌株的毒力检测：为了评估菌的潜在致病性，对其是否含一些毒力基因进行检测，方法是对这些毒力基因进行PCR，需要检测的毒力基因包括asa1，即聚集物、ace，即胶原蛋白黏附素、esp，即肠球菌表面蛋白、efaAfm，即细胞壁黏附素、cylA/B，即细胞溶素的活化和表达，其中不同引物的退火温度不同，实验中按照各自引物的退火温度设置PCR程序，PCR结束后将PCR扩增产物置于4℃保存，取PCR扩增产物与溴酚兰混匀后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，在自动凝胶成像仪中观察、拍照记录。


2.根据权利要求1所述的一种产细菌素菌株的分离筛选和检测鉴定方法，其特征在于：所述的常用培养基的配制主要包括MRS培养基及BHI培养基。


3.根据权利要求1所述的一种产细菌素菌株的分离筛选和检测鉴定方法，其特征在于：所...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵亮，吴明华，许剑，钱程，
申请(专利权)人：江苏永盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32