结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种结合小鼠PD‑L1和TGF‑β的双特异性抗体及其制备方法与应用，属于免疫学和抗体工程技术领域。该双特异性抗体包括两条对称分布且成形配对的长链和位于各长链外侧且分别与各长链配对的短链，各长链的氨基酸序列为SEQ ID NO:1且包含如下式I所示多肽链，各短链的氨基酸序列为SEQ ID NO:2且包含如下式II所示多肽链：VHa‑CH1‑X1‑VLb‑X2‑CH2‑CH3，式I；VLa‑CL‑X1‑VHb，式II。本发明专利技术公开的双特异性抗体以高亲和力与小鼠PD‑L1以及TGF‑β进行特异性结合，通过调节各抗原所参与的信号传导通路来发挥良好的生物学功能。

【技术实现步骤摘要】
结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种新制备的双特异性抗体，属于免疫学和抗体工程
，具体地涉及一种结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体及其制备方法与应用。
技术介绍
单克隆抗体是仅作用于单一抗原表位的高度特异性抗体，已被广泛用于许多疾病的治疗，例如癌症、炎性疾症、自身免疫性疾病和感染性疾病。但是，这种治疗分子在单独使用时，该治疗分子不能显示出足够的药效。这可能是由于疾病的复杂性。例如，癌症或炎性疾病通常涉及多种疾病介导的分子通路以及信号通路之间的相叉作用。在这些情况下，靶向单一靶标的分子不能提供最佳的治疗效果。通过同时阻断多个靶标或者阻断同一靶标的多个位点处的分子能够改善治疗效果。由于多特异性分子、例如双特异性分子是单一分子，多特异性分子可以使得进行双靶向治疗可以简化新药的开发过程。与使用多个单特异性分子组合相比，使用多特异性分子对于患者和医疗服务提供者都更方便。已经通过抗体过程开发了大量富于想象力的双特异性抗体样式并且研究了它们在疾病应用上的适应性。如2014年12月03日美国FDA审批安进公司研发的双特异性抗体Blincyto(Blinatumomab)上市，用于急性淋巴细胞白血病的治疗，又如默克公司研发的目前仍处于临床阶段的M7824，M7824是一种新型的双功能融合蛋白，该蛋白由靶向PD-L1蛋白的IgG1单克隆抗体和人类转化生长因子-β(TGF-β)受体II型融合而成。简单来说，这种双功能蛋白既能抑制PD-L1蛋白配体，又能抑制TGF-β通路，双管齐下，能促进免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤。并且，同时靶向这两个系统或可克服肿瘤细胞对PD-1/PD-L1疗法的抗药性。这样就会极大地提升药物的有效率，并降低联合用药的副作用。PD-1/PD-L1单抗因抗癌谱广、疗效持久、副作用易耐受而备受瞩目。在肿瘤微环境中，过度活化的PD-1/PD-L1通路抑制机体对肿瘤细胞的免疫监视和清除效应。传统认为肿瘤细胞高表达的PD-L1与T细胞表面的PD-1结合而抑制T细胞的免疫活性，PD-1/PD-L1单抗通过阻断这一负性免疫调控信号，解救T细胞，恢复抗肿瘤免疫。但是，从临床疗效看，PD-L1的不能很好的预测患者的疗效，甚至一些肿瘤不表达PD-L1的患者也能获益。近期研究发现在肿瘤-免疫循环模型中，除了公认的PD-1/PD-L1通路，肿瘤微环境中高表达的TGF-β也可以广泛的调控多种免疫相关的效应细胞活性，重塑肿瘤免疫微环境，共同参与肿瘤细胞免疫逃逸。TGF-β可能成为制约抗肿瘤免疫应答的限速步骤，从而影响PD-1/PD-L1抗体的疗效。TGF-β具有多种生物学功能，对细胞的生长增殖、分化、凋亡、迁移和免疫都有重要的调节作用。TGF-β存在三个亚型，分别为TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其三个亚型均可以结合细胞表面相同的受体。TGFBR1和TGFBR2具有相似的配体结合亲和力，对TGF-β1/3具有高亲和力，对TGF-β2具有低亲和力。TGFBR3对TGF-β1/2均具有高亲和力，同时也可以结合TGF-β3。此外，TGF-β在进化上也高度保守，人源的TGF-β1与猪/狗/牛具有100％的氨基酸序列同源性，与小鼠/大鼠/马具有99％的氨基酸序列同源性；人源的TGF-β2与猪/犬/马/牛具有100％的氨基酸序列同源性，与小鼠/大鼠的TGF-β2具有97％的氨基酸序列同源性；人源的TGF-β3与小鼠/狗/马具有100％氨基酸序列同源性，与大鼠具有99％的氨基酸序列同源性，与猪具有98％的氨基酸序列同源性。上述几个物种的TGF-β均具有很强的种属交叉活性。肿瘤组织中TGF-β由肿瘤细胞、免疫细胞和间质细胞产生。高表达的TGF-β不仅促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，而且作用于多种肿瘤微环境中的免疫细胞，诱导抑制性肿瘤免疫微环境的产生。TCGA数据库分析显示，活化的TGF-β信号活化和与肿瘤不良预后相关。活化的TGF-β信号导致PD-1抑制剂的耐药，并且预测PD-1疗效的准确性高于常用的标志物：突变负荷、T细胞杀伤活性，CAF及T细胞炎症反应信号(Tcell-inflamedsignature)。结肠癌肝转移是重要致死原因，与原发灶相比，转移瘤并无一致性的基因突变。Tauriello等对转移瘤微环境的分析显示T细胞缺乏、TH1型细胞和免疫杀伤细胞活性低，升高的TGF-β表达提示预后不良。通过基因工程技术构建Apc，Kras，TGFR2和p53四重突变小鼠，建立转移癌模型。发现转移癌组织显示微卫星稳定性肠癌的特征：低突变负荷，T细胞耗竭和TGF-β活化。正常肠粘膜和腺瘤的间质有T细胞侵润，而邻近的癌组织则没有。PD-1治疗对这些肿瘤的效果有限，相反，使用TGF-β抑制剂引起持久的T细胞活化，可阻止肝转移；对已进展到肝转移的小鼠，TGF-β抑制剂增加PD-1治疗的敏感性。结果支持肿瘤组织微环境高活性TGF-β引起T细胞耗竭和TH1效应细胞减少，导致免疫逃难机理。Mariathasan等分析转移性尿道上皮癌患者接受PD-1免疫治疗的癌组织，有效患者的特征为PD-L1表达，高突变负荷/新抗原，效应性T细胞和肿瘤组织高突变负荷；无效患者的肿瘤组织含致密的间质和CAF高TGF-β活性，T细胞缺乏。小鼠乳腺癌EMT-6模型模拟上皮癌的表型，单独阻断PD-L1或TGF-β的效果均不佳，联合抑制TGF-β和PD-1信号，减少基质细胞的TGF-β活性，促进T细胞进入肿瘤，刺激强烈的免疫应答，导致肿瘤退缩。总之，多项研究显示PD-1或PD-L1抵抗的肿瘤组织TGF-β通路活性显著增加，肿瘤微环境中高表达的TGF-β抑制机体对瘤细胞的免疫反应。TGF-β和PD-1/PD-L1通路对于肿瘤的免疫抑制机制相互独立并且互为补充，共同促进肿瘤逃避机体的免疫监视。协同阻断PD-L1和TGF-β双抑制信号，可更有效的促进ImmuneExcluded肿瘤向ImmuneInflamed肿瘤的转化，从而提高PD-L1单抗敏感肿瘤的有效率，并可拓宽PD-L1单抗的抗癌谱。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体及其制备方法与应用。本专利技术制备的抗体包含至少2个抗原结合位点，其中一个特异性结合小鼠PD-L1，另一个特异性结合TGF-β，其能够作为双特异性抗体发挥协同作用。为实现上述目的，本专利技术公开了一种结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体，它包括两条对称分布且成形配对的长链和位于各所述长链外侧且分别与各所述长链配对的短链，各所述长链的氨基酸序列为SEQIDNO:1且包含如下式I所示多肽链，各所述短链的氨基酸序列为SEQIDNO:2且包含如下式II所示多肽链：VHa-CH1-X1-VLb-X2-CH2-CH3式I；VLa-CL-X1-VHb式II；其中，所述式I中：VHa代表抗小鼠PD-L1重链可变区；CH1、CH2、CH3代表重链恒定区结构域；VLb代表抗小鼠TGF-β区域的轻链可变区；<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体，其特征在于，它包括两条对称分布且成形配对的长链和位于各所述长链外侧且分别与各所述长链配对的短链，各所述长链的氨基酸序列为SEQ ID NO:1且包含如下式I所示多肽链，各所述短链的氨基酸序列为SEQ IDNO:2且包含如下式II所示多肽链：/nVHa-CH1-X1-VLb-X2-CH2-CH3式I；/nVLa-CL-X1-VHb式II；/n其中，所述式I中：/nVHa代表抗小鼠PD-L1重链可变区；/nCH1、CH2、CH3代表重链恒定区结构域；/nVLb代表抗小鼠TGF-β区域的轻链可变区；/n所述式II中：/nVLa代表抗小鼠PD-L1轻链可变区；/nCL代表轻链恒定区；/nVHb代表抗小鼠TGF-β区域的重链可变区；/n且，所述式I和式II中，X1、X2代表连接肽。/n

【技术特征摘要】
1.一种结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体，其特征在于，它包括两条对称分布且成形配对的长链和位于各所述长链外侧且分别与各所述长链配对的短链，各所述长链的氨基酸序列为SEQIDNO:1且包含如下式I所示多肽链，各所述短链的氨基酸序列为SEQIDNO:2且包含如下式II所示多肽链：
VHa-CH1-X1-VLb-X2-CH2-CH3式I；
VLa-CL-X1-VHb式II；
其中，所述式I中：
VHa代表抗小鼠PD-L1重链可变区；
CH1、CH2、CH3代表重链恒定区结构域；
VLb代表抗小鼠TGF-β区域的轻链可变区；
所述式II中：
VLa代表抗小鼠PD-L1轻链可变区；
CL代表轻链恒定区；
VHb代表抗小鼠TGF-β区域的重链可变区；
且，所述式I和式II中，X1、X2代表连接肽。


2.根据权利要求1所述结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体，其特征在于，式I中所述CH1与式II中所述CL之间化学键连接。


3.根据权利要求1所述结合抗小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体，其特征在于，两条所述长链的X2之间化学键连接。


4.根据权利要求1～3中任意一项所述结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体，其特征在于，所述X1的序列信息为GGGGSEAAAKGGGGS。


5.根据权利要求1～3中任意一项所述结合小鼠PD-L1和TGF...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴孔明，易铭，方丽娟，严永祥，周鹏飞，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，武汉友芝友生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42