用有限体积阵列进行样品细胞表型评估的组合物和方法技术

本发明专利技术的特定实施方案涉及通过记录和解释时间依赖性信号来评估和识别细胞，所述时间依赖性信号由分离的活细胞的独特细胞呼吸和渗透性属性产生。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用有限体积阵列进行样品细胞表型评估的组合物和方法相关申请的交叉引用本申请要求2018年6月13日提交的美国临时专利申请序列第62/684736号和2018年10月18日提交的第62/747309号，每一个都通过引用整体并入本文。
本公开一般涉及细胞生物学和微生物学，更具体地涉及用于快速且灵敏地进行细胞表型评估的组合物和方法，以及它们对化合物和/或治疗的表型响应的快速且灵敏的表征。
技术介绍
在各种情况下，发现致病细胞(DCC)的量低于常规分析技术的检测限。因此，根据应用，用于识别DCC和表征它们对治疗的响应的方法通常需要靶细胞的增殖和/或靶细胞的分子内容物和/或产物的靶依赖性扩增。与其他技术相比，由于具有高灵敏度，核酸扩增(例如，基于PCR)测试(NAT)已成为快速病原体识别的优选方法。使用PCR可在数小时内将DNA从单拷贝扩增至数十亿拷贝。NAT需要复杂的样品工作流程步骤，其通常包括细胞裂解，然后是核酸浓缩步骤，该步骤也从样品中去除PCR抑制剂。细胞裂解造成在核酸提取效率要求的不对称性。例如，与革兰氏阴性细菌相比，分枝杆菌和真菌具有非常厚的细胞壁，因此更难溶解，通常需要机械裂解步骤以有效破坏它们的细胞壁。因此，利用简单化学裂解方法的NAT通常对这些更棘手的病原体缺乏敏感性。此外，细胞裂解试剂可以抑制PCR反应，因为试剂使蛋白质变性，并且PCR利用蛋白质进行扩增反应。因此，细胞裂解需要引入高效洗涤步骤以从提取的核酸中去除裂解试剂。此外，NAT需要昂贵的分析开发方法，因为它们依赖于必须对每个靶特别设计的病原体特异性报告分子(引物和探针)。因此，每个NAT必须包括昂贵的分子研发过程，其涉及引物/探针设计和每个靶的筛选。包含两个或多于两个靶的NAT(多重)无法准确并精确地同时量化这些靶。这是因为报告分子种类之间相同的非特异性相互作用引起PCR信号输出的变化，并且定量PCR依赖于可重复的反应结果，以将产生的扩增曲线与初始目标浓度相关联。这是明显的限制，因为它限制了使用多重NAT诊断产生大部分感染的身体非无菌感染区域的感染。在身体非无菌区域，人们通常被可以引起感染的相同病原体定植。因为感染是由压垮身体防御的微生物引起的，所以它们将通常产生比共生菌更多的菌落分离株。因此，在非无菌感染位点，临床样品中存在的病原体的数量(病原体负荷)决定细菌种类是引起感染还是“平静地”定殖于该位点。例如，为了明确诊断来自下呼吸系统(例如支气管肺泡灌洗液(BAL))的肺炎感染源，样品中存在的任何细菌的病原体负荷必须超过103CFU/mL才能被认为是感染源。类似地，对于尿液样品，阈值为105CFU/mL。此外，如果NAT测定包括多于一种目标(多重测定)，需要多于一种报告分子种类(引物和/或探针对)，则不同的靶和/或报告分子种类可以与彼此非特异性相互作用，当报告分子非特异性地对抗其他试剂扩增时，导致假阳性，或当靶扩增反应被与另一种类的非特异性相互作用抑制时，导致假阴性。因此，这限制了在单个NAT内可以识别的靶的数量。这与耐药性问题特别相关，因为在革兰氏阴性细菌和分枝杆菌的情况下，存在许多指示耐药性的突变(每个突变是靶)。NAT只能在一次测试中检测这些突变的一小部分。此外，存在于生物体基因型中的基因可能并不总是呈现表型。因此，基因型信息通常描绘了病原体表型响应的不准确或不完整的图像。例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)通常不表达赋予耐药性的mecA基因。因此，当涉及引起感染的病原体是否对特定药物敏感的临床重要确定时，NAT的临床有效性低，因为这些测试只能检测能够带来抗菌剂耐药性的小部分基因突变并且根本不能解释表观遗传耐药性机制。还必须使NAT工程化，以检测充分理解的遗传耐药性标记。然而，在由抗菌药物引入的选择性压力下，微生物不断进化出新的耐药性机制。通过依赖随时间改变的信息(基因型)，随着微生物进化出新的耐药性机制，NAT变得更不准确。为了跟上从根本上改变的抗菌剂耐药性局面，必须研究和理解新耐药性机制，并且必须开发新NAT和必须清除进入临床的监管障碍。这昂贵的过程会持续数年。表型抗菌剂易感性测试(AST)仍然是用于诊断微生物感染的黄金标准，因为它测量了表型微生物对考虑用于治疗的抗菌药物响应，并且因此依赖于直接转化为所需临床反应的功能终点。AST是表型的，包括所有耐药性机制，因此提供了高的临床有效性。AST实现了最低抑制浓度(MIC)的测定，其对应于明显抑制微生物生长所需的微生物药的最低浓度。因为不同微生物具有不同的固有特征，所述固有特征会影响其针对给定抗菌药物的所观察到的响应，因此仅凭MIC无法告知临床医生病原体对抗生素是否敏感或耐药。例如，苯唑西林的MIC为2μg/mL，表明如果病原体是金黄色葡萄球菌(其因此对苯唑西林治疗有响应)时对苯唑西林的敏感性，和如果病原体是表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)(其因此对治疗无响应)时对苯唑西林的耐药性。为了解释任意的AST结果，需要进行病原体身份识别(ID)。如果多种病原体存在于同样的测试中，则无法准确执行AST，因为物种之间的微生物生长是不可区分的，并且不能具体测量物种的抗生素响应。此外，在抗菌药物的选择性压力下，可以提高资源的竞争，模糊抗菌剂本身的影响。这特别重要，因为大部分细菌感染发生在经常充满细菌的身体区域。对于非无菌位点的感染，识别并分离引起感染的细菌(病原体)是重要的，所述细菌来自“平静地”存在于感染位点的那些(共生菌)。这防止了样品在液体肉汤培养基中的培养，所述液体肉汤培养基使用起来更简单，并且通常会加速微生物的生长。相反，需要定量或半定量培养，其通过将样品以不同浓度铺展在培养皿上来实现，以在板上的某些点上，微生物将在单个物种的独立菌落中生长。平板划线还允许实验室技术人员对以一定浓度存在的视觉上可区分的菌落进行计数，以确定样品中的微生物是否具有侵入性。由不同物种形成的菌落可以在视觉上互相区分并进行计数。实验室技术人员还可以手动提取完全由相同的物种组成的病原体菌落用于进一步测试。因此，定量/半定量培养过程不仅产生随后AST所需的大量细胞，还确保被测试的细菌是同质的并且是引起感染的那些(病原体)。然而，定量/半定量培养是高度主观并容易出错的，需要高技能技术人员来决定在随后的测试中排除或包括哪个菌落。多种微生物感染特别具有挑战性。通常，其中一种感染病原体是挑剔的生物体(具有复杂的营养需求并一般只生长在特定条件下的生物体)或缓慢生长的生物体，另一种则不是。不挑剔的/生长较快的生物体通常会淹没培养板上的挑剔的/生长较慢的生物体，并隐藏它在样品中的存在。因为AST需要前期的培养生长步骤，以产生对用于治疗的候选药物进行评估所需的大量细胞，在培养皿上孵育一天至五天可以使微生物群体从患者样品中存在的数量增长到AST所需的数量，这对于有效引导抗生素治疗决策来说是非常慢的，特别是对于严重的细菌感染。因此，仍然需要用于以快速和/或有效方式识别和表征样品中的细胞的其他方法和装置。
技术实现思路
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【技术保护点】
1.一种用于评估样品的方法，其包括：/n(a)将样品分成两个或多于两个子样品或样品部分，包含对照子样品和至少一个测试样品；/n(b)将每个子样品或样品部分与一种或多于一种试剂、一种或多于一种反应物、或一种或多于一种试剂和一种或多于一种反应物混合，形成不同的子样品或样品部分混合物；/n(c)将每个子样品或样品部分混合物分区至多个小体积区室，其中一些小体积区室含有一个细胞或一个细胞聚集体；/n(d)检测小体积区室的物理或化学特征随时间的变化并生成与每个区室相关的数据；和/n(e)将数据作为输入信息传输到使用机器学习优化的至少一个函数并生成分析输出信息。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180613 US 62/684,736;20181018 US 62/747,3091.一种用于评估样品的方法，其包括：
(a)将样品分成两个或多于两个子样品或样品部分，包含对照子样品和至少一个测试样品；
(b)将每个子样品或样品部分与一种或多于一种试剂、一种或多于一种反应物、或一种或多于一种试剂和一种或多于一种反应物混合，形成不同的子样品或样品部分混合物；
(c)将每个子样品或样品部分混合物分区至多个小体积区室，其中一些小体积区室含有一个细胞或一个细胞聚集体；
(d)检测小体积区室的物理或化学特征随时间的变化并生成与每个区室相关的数据；和
(e)将数据作为输入信息传输到使用机器学习优化的至少一个函数并生成分析输出信息。


2.根据权利要求1所述的方法，其还包括：
(f)将数据作为输入信息传输到(i)至少一个神经网络和(ii)表征器，形成神经网络输出信息和表征器输出信息；
(g)将神经网络输出信息传输到分类器并形成分类器输出信息；和
(h)将表征器输出信息和分类器输出信息传输到第二神经网络，所述第二神经网络形成分析输出信息。


3.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是环境样品或生物样品。


4.根据权利要求3所述的方法，其中所述生物样品是患者样品。


5.根据权利要求4所述的方法，其中所述患者是人类患者。


6.根据权利要求4所述的方法，其中所述生物样品是支气管肺泡灌洗液(BAL)、痰、唾液、尿液、血液、脑脊液、精液、粪便、拭子、刮除物、脓或组织。


7.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照子样品不包含反应物。


8.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照子样品不包含试剂。


9.根据权利要求1所述的方法，其中将一个或多于一个子样品与试剂和反应物混合。


10.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应物是营养混合物或药物。


11.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为荧光试剂或发光试剂。


12.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析输出信息是临床终点的决定。


13.根据权利要求12所述的方法，其中所述临床终点是患者治疗成效、药物的...

【专利技术属性】
技术研发人员：马修·费舍尔，尼古拉斯·阿拉伯，罗丝·约翰逊，大卫·布西安，
申请(专利权)人：派特恩生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US