一株具有交叉保护力的血清14型副猪嗜血杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一株血清14型副猪嗜血杆菌强毒株及其应用。该14型副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）HN1513于2018年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：16807。该菌株对保育仔猪具有较强的致病力，能够引起保育猪发病死亡，其作为抗原制备的灭活疫苗对14型的感染具有100%的保护率，对1‑13型、15型及不能分型的副猪嗜血杆菌的感染均具有较好的交叉保护力。

【技术实现步骤摘要】
一株具有交叉保护力的血清14型副猪嗜血杆菌及其应用
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一株血清14型副猪嗜血杆菌强毒株及其应用。
技术介绍
副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis，HPS）是猪副猪嗜血杆菌病的病原菌，主要引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。副猪嗜血杆菌病在全世界范围内广泛存在，已成为近年来断奶、保育仔猪死亡的主要原因之一，是临床混合感染的主要病原之一，给养猪业造成较大的经济损失，严重影响养猪业的健康发展。副猪嗜血杆菌临床血清型较多，标准分型有15个血清型，临床上还有20%以上的不可分型菌株，各地流行菌株血清型不一，各血清型之间缺乏免疫交叉保护能力。疫苗免疫接种是防控副猪嗜血杆菌病的最佳途径，国内副猪嗜血杆菌商品化疫苗多为针对血清4型、5型的二价疫苗或4、5、13的三价或4、5、12、13型的4价疫苗，目前国内主要流行4、5、12、13、14型，对14型没有疫苗，因此亟需一种新的血清14型毒株且对所有血清型和不能分型的副猪嗜血杆菌的感染都具有较好保护率的疫苗。
技术实现思路
针对目前副猪嗜血杆菌各地流行血清型不一，存在多种疫苗但仍缺乏14型副猪嗜血杆菌疫苗的缺陷和问题，本专利技术提供一株血清14型副猪嗜血杆菌强毒株及其应用。本专利技术解决其技术问题所采用的方案是：一株副猪嗜血杆菌，所述副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis）HN1513，保藏编号为CGMCCNO：16807，保藏日期为2018年11月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。上述的副猪嗜血杆菌，所述副猪嗜血杆菌为14型。本专利技术的副猪嗜血杆菌在制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗方面的应用。上述的的应用，所述副猪嗜血杆菌灭活疫苗中副猪嗜血杆菌的含量为1×1010CFU/mL。上述的应用，所述副猪嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法为：将所述副猪嗜血杆菌依次经过增殖、灭活、浓缩后得到的副猪嗜血杆菌抗原液，向抗原液中加入免疫佐剂即得疫苗。上述的应用，所述免疫佐剂为畜禽用水包油包水佐剂SummitS550。上述的应用，所述副猪嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法为：（1）增殖：将副猪嗜血杆菌血清14型HN1513株菌株分别繁殖培养，获得8株副猪嗜血杆菌菌液，并分别进行活菌计数；（2）灭活：向步骤（1）中获得的副猪嗜血杆菌HN1513株菌液中按照菌液体积的0.2%加入甲醛溶液，于37℃灭活48h；（3）浓缩：使用超滤装置浓缩灭活后检验合格的副猪嗜血杆菌HN1513株菌液，根据灭活前的活菌计数，用无菌生理盐水调整浓缩终浓度为1.0×1010CFU/mL；（4）制备疫苗：将增殖、灭活、浓缩后获得的副猪嗜血杆菌HN1513株抗原液，加入终体积30%的畜禽用水包油包水佐剂，混匀制得副猪嗜血杆菌灭活疫苗。本专利技术的有益效果：本专利技术从临床分离株中筛选出菌株副猪嗜血杆菌HN1513株菌株，该菌株对保育仔猪具有较强的致病力，能够引起保育猪发病死亡；通过试验发现用HN1513株副猪嗜血杆菌作为菌株抗原制备的灭活疫苗对14型的感染具有100%的保护率，对1-13型、15型及不能分型的副猪嗜血杆菌的感染均具有较好的交叉保护力，说明副猪嗜血杆菌HN1513株菌株有良好的免疫原性；而且本专利技术疫苗制备工艺简单，无毒副作用，安全性好，免疫期长、免疫效果好，能够用于工业生产。附图说明图1为本专利技术14型副猪嗜血杆菌HN1513株的细菌形态。图2为本专利技术14型副猪嗜血杆菌HN1513株的PCR分型鉴定结果；图中Marker为DL2000bp，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp；泳道1-2为HN1513株的16SrRNA基因扩增结果；泳道3为14型标准株的16SrRNA基因扩增结果；泳道4-6为HN1513株14型的funAB基因的扩增结果；泳道7为14型标准株的的funAB基因的扩增结果；泳道8为阴性对照。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明。实施例1：副猪嗜血杆菌的分离鉴定1.1病料来源2018年8月采集来自河南某规模化猪场具有疑似副猪嗜血杆菌病临床症状猪的病例的肺脏、心血、淋巴结、脾脏、脑、关节液等病料，发病猪表现为发热、呼吸困难、关节肿胀、跛行、皮肤及黏膜发绀、站立困难甚至瘫痪、僵猪或死亡。1.2培养基配制TSB液体培养基：将TSB肉汤粉（TrypticSoybroth，胰蛋白胨大豆肉汤，BD公司）30g，溶于1000mL超纯水中，115℃灭菌15min，加胎牛血清50mL（Hychone公司）、无菌1%NAD（Nicotinamideadeninedinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶Ⅰ，Roche公司）1mL。TSA固体培养基：将TSA琼脂粉（TrypticSoyAgar，胰蛋白胨大豆琼脂，BD公司）40g，溶于1000mL超纯水中，115℃灭菌15min，加胎牛血清50mL、无菌1%NAD1mL；于4℃保存备用。1.3副猪嗜血杆菌的分离培养无菌条件下采集发病或死亡猪的肺脏、心血、淋巴结、脾脏、脑、关节液等病料接种于含有NAD的TSA固体培养基上，37℃恒温培养箱中培养36h，挑取疑似菌落进行传代纯化，再培养24～48h后观察副猪嗜血杆菌的菌落形态，如图1所示，长出一致的针尖状大小、无色透明、光滑、湿润的，直径大小为1～2毫米的菌落；纯化的同时并接种于不含NAD的TSA固体培养基上，在不含NAD的TSA培养基上不能生长；挑取纯化的单个菌落进行革兰氏染色镜检，观察菌体形态特征为革兰氏阴性菌，细长杆菌，多丝状的菌体。1.4副猪嗜血杆菌的鉴定和血清型鉴定1.4.1引物设计通过聚合酶链反应（PCR）技术对临床分离疑似株进行副猪嗜血杆菌鉴定和分型鉴定。副猪嗜血杆菌和血清14型的引物序列和扩增片段长度见表1。1.4.2PCR反应PCR反应体系为25μL体系包括10×TapPCRmastermix13μL，上、下游引物各1.0μL，无菌水5.0μL，模板5μL。反应条件为：94℃变性5min后，94℃30s，54℃30s，72℃40s，进行30个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物于4℃保存。取PCＲ产物10μL，经1%琼脂糖凝胶100V电压下电泳45min后用凝胶成像系统分析观察结果，阳性结果测序比对。通过对采集的疑似样品进行细菌分离、纯化、鉴定，分离出一株副猪嗜血杆菌，通过基因比对，分离株与14型副猪嗜血杆菌标准株的16SrRNA、funAB基因序列的同源性均在100%。经PCR分子血清分型鉴定，结果为血清型14型，鉴定结果见图2。funAB基因的序列如下，将分离鉴定的14型副猪嗜血杆菌命名为HN1513，并进行了保藏。GCTGGTTATGACTATTTCT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株副猪嗜血杆菌，其特征在于：所述副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis）HN1513，保藏编号为CGMCC NO：16807，保藏日期为2018年11月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。/n

【技术特征摘要】
1.一株副猪嗜血杆菌，其特征在于：所述副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis）HN1513，保藏编号为CGMCCNO：16807，保藏日期为2018年11月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。


2.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌，其特征在于：所述副猪嗜血杆菌为14型。


3.一种副猪嗜血杆菌在制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗方面的应用。


4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述副猪嗜血杆菌灭活疫苗中副猪嗜血杆菌的含量为1×1010CFU/mL。


5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述副猪嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法为：将所述副猪嗜血杆菌依次经过增殖、灭活、浓缩后得到的副猪嗜血杆菌抗原液，向抗原液中加入免疫佐剂即...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐引弟，王治方，张青娴，焦文强，朱文豪，许峰，李海利，郎利敏，张立宪，游一，王克领，
申请(专利权)人：河南省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41