一种水丛毛单胞菌菌株、生防菌剂及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种水丛毛单胞菌菌株，命名为水丛毛单胞菌Ca30，保藏日期为2020年11月9日，保藏编号：CGMCC NO.21152；本发明专利技术的水丛毛单胞菌Ca30，生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可以通过简单、快捷低成本的制备方法获得防治水稻纹枯病的生防菌剂，经过试验证明，本发明专利技术提供的生防菌剂在离体条件下处理水稻叶片后使得水稻纹枯病的发病面积减少了94.57％，温室条件下对水稻纹枯病的防治效果达到了65.26％，其防治效果与常用化学农药噻呋·苯醚甲持平，其抑菌效果非常明显。

【技术实现步骤摘要】
一种水丛毛单胞菌菌株、生防菌剂及其制备方法与应用
本专利技术涉及微生物应用
，具体涉及一种水丛毛单胞菌菌株、生防菌剂及其制备方法与应用。
技术介绍
水稻(Oryzasativa)是全球重要的粮食作物之一，全世界近2/3以上的人口以稻米为食，尤其是在亚洲、拉丁美洲和非洲。即使在大田管理越来越科学的情况下，水稻的生产过程中仍然避免不了环境中的生物胁迫和非生物胁迫给水稻产量和品质带来的巨大损失。病害被认为是水稻生产的主要品质制约和产量限制因素，目前，超过70多种由真菌，细菌，病毒或线虫引起的病害被报道。由立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)侵染引起的水稻纹枯病(Ricesheathbight)是水稻的三大病害之一。条件和温度适宜时，其发病率可达2.5％-50％。水稻纹枯病菌的有性态是担子菌亚门真菌的瓜亡革菌。菌丝初期为白色，稀疏，后期逐渐变褐色，菌丝聚集、纠结从而产生菌核。水稻纹枯病是一种典型的土传性真菌病害，主要以菌核、病残体的形式在土壤中越冬，翌年通过雨水传播。该病害在水稻的整个生育期都可发生，危害大、流行性强、寄主范围广，其主要危害部位为叶鞘和叶片，产生的菌核能抗逆和忍耐极端环境,对稻米的高产稳产造成了重大的影响。近年来随着矮杆、多蘖良种的推广应用以及栽培密度、氮肥使用量的增加，其危害程度日益严重，在我国尤其是南方造成了严重的经济损失。在尚无有效抗病品种的情况下，主要依赖于药剂来防治水稻纹枯病，尤其是井冈霉素、噻呋酰胺，虽然防治简便、效果迅速，但长期大规模使用单一药剂会导致病原物抗性增强，防治效果逐渐降低，而剂量不断加大后也会污染环境，造成恶性循环。因考虑环境及人体健康等问题，欧盟早已于2002年提议禁止使用井冈霉素。因此寻找安全的防治措施和新型的防治材料并探究其机理具有重要的研究价值。生物防治，是利用有益微生物或者有益微生物的代谢物对作物病害进行防治，对人、畜安全和对环境污染极少，逐渐被研究学者们所重视，具有良好的应用前景。目前，利用生防细菌来防治水稻纹枯病的研究非常多，其中发现最多为芽孢杆菌(Bacillussp.)和假单胞杆菌(Pseudomonassp.)和假单胞杆菌(Pseudomonassp.)。由于这些细菌菌株绝大部分并非来自水稻根际，导致其在水稻大田难以表现良好的抗病活性。有鉴于此，从水稻根际分离具有高抗病活性的菌株才有潜能真正用于稻田防病。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决以上现有技术的不足，提供一种可以防治水稻纹枯病的细菌菌株，还提供了一种包含上述细菌菌株的生防菌剂，可以很好地应用于水稻纹枯病的防治工作中。为实现本专利技术的上述目的，采用了以下技术方案：一种水丛毛单胞菌菌株，命名为水丛毛单胞菌Ca30，分类命名为水生丛毛单胞菌Comamonasaquatica，保藏日期为2020年11月9日，保藏地址：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号：CGMCCNO.21152。本专利技术的水丛毛单胞菌菌株为2019年在南京市江宁区汤山镇水稻根围土壤中分离得到；分离方法：采用5点取样法取田间土壤后分别装入灭菌的封口塑料袋中，立即带回实验室；将土样5g加入45mL无菌水中，于摇床150r/min振荡培养1h后，使用无菌纱布过滤得悬浮液并采用10倍系列稀释法得到10-6倍稀释液。分别取100μL稀释液均匀涂布于NA平板上，于28℃恒温培养箱中培养48h后，挑取颜色、光泽度、大小和类型不同的单菌落，划线纯化菌株，统一编号后转入于NA斜面培养基中，用80％灭菌甘油保存，置于-70℃保存备用。平板对峙法：选取培养2d的水稻纹枯病菌菌饼(5mm)置于PDA平板中央，在距离菌饼25mm处呈三点对称的3个点打孔(直径5mm)并注入100μL供试菌株的发酵培养液，以加入100μLNB为对照组。28℃恒温培养48h后，观察和测量抑菌带的大小，实验重复三次，选出抑菌圈最大的菌株，即为水丛毛单胞菌Ca30。生物学特性：革兰氏阴性菌，菌体为球形，有鞭毛，无荚膜。菌落形态：圆形，菌落直径较大，表面光滑，垫状，不透明，边缘完整。含有所述水丛毛单胞菌Ca30的生防菌剂也属于本申请要求保护的范围，制备方法是将水丛毛单胞菌Ca30经菌体活化、种子培养、扩大培养后得到。具体的制备方法优选包括以下步骤：将水丛毛单胞菌Ca30在NB培养基中，25～30℃、150～200rpm振荡培养12～24h，获得种子液；将种子液以1％的接种量接种于基础盐培养基，于25～30℃、150～200rpm振荡培养，获得活菌总浓度为1×108～1×109CFU/mL的生防菌剂成品。本专利技术还提供了一种上述水丛毛单胞菌菌株或生防菌剂在防治水稻纹枯病中的应用。具体方法为：在使用前，将制得的生防菌剂稀释至OD＝1.0，在水稻苗期喷施叶片。本专利技术的有益效果如下：(1)本专利技术的生防菌剂中含有抑制水稻纹枯病病原菌生长的专一性菌株水丛毛单胞菌Ca30，其抑菌效果非常明显，经过试验证明，本专利技术提供的生防菌剂在离体条件下处理水稻叶片后使得水稻纹枯病的发病面积减少了94.57％，温室条件下对水稻纹枯病的防效达到了65.26％，其防效与常用化学农药噻呋·苯醚甲持平；(2)本专利技术的水丛毛单胞菌Ca30，生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可以通过简单、快捷低成本的制备方法获得防治水稻纹枯病的生防菌剂；(3)本专利技术提供的生防菌剂为微生物防治剂，无公害，不产生环境污染，可以减少甚至不用其他相应化学农药，不仅节省农民开支，还提高稻米品质；(4)经过试验证明，本专利技术提供的生防菌剂，具有抗病作用，进而大幅度促进农民增收。具体实施方式为了加深对本专利技术的理解，下面将结合实施例对本专利技术作进一步详述，该实施例仅用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术保护范围的限定。实施例1：水丛毛单胞菌Ca30的分离纯化与鉴定本专利技术所涉及的防治水稻纹枯病的水丛毛单胞菌Ca30，为2019年在南京市江宁区汤山镇水稻根围土壤中分离得到。分离方法：采用5点取样法取田间土壤后分别装入灭菌的封口塑料袋中，立即带回实验室；将土样5g加入45mL无菌水中，150r/min下于摇床振荡培养1h后，使用无菌纱布过滤得悬浮液并采用10倍系列稀释法得到10-6倍稀释液。分别取100μL稀释液均匀涂布于NA平板上，于28℃恒温培养箱中培养48h后，挑取颜色、光泽度、大小和类型不同的单菌落，划线纯化菌株，统一编号后转入于NA斜面培养基中，用80％灭菌甘油保存，置于-70℃保存备用。平板对峙法：选取培养2d的水稻纹枯病菌菌饼(5mm)置于PDA平板中央，在距离菌饼25mm处呈三点对称的3个点打孔(直径5mm)并注入100μL供试菌株的发酵培养液，以加入100μLNB为对照组。28℃恒温培养48h后，观察和测量抑菌带的大小，实验重复三次，选出抑菌圈最大的菌株Ca30。生物学特性：革兰氏阴性菌，菌体为球形，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水丛毛单胞菌菌株，其特征在于，命名为水丛毛单胞菌Ca30，保藏日期为2020年11月9日，保藏编号：CGMCC NO.21152。/n

【技术特征摘要】
1.一种水丛毛单胞菌菌株，其特征在于，命名为水丛毛单胞菌Ca30，保藏日期为2020年11月9日，保藏编号：CGMCCNO.21152。


2.含有权利要求1所述水丛毛单胞菌菌株的生防菌剂。


3.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于，生防菌剂中活菌总浓度为1×108～1×109CFU/mL。


4.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于，所述的生防菌剂由权利要求1所述的水丛毛单胞菌菌株经菌体活化、种子培养、扩大培养后得到。


5.一种如权利要求4所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张磊，韩先旭，丁浩然，郭威，牛冬冬，李根，
申请(专利权)人：镇江敖来生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32