一株高产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母及其应用制造技术

本发明专利技术具体涉及一株高产β‑胡萝卜素的解脂耶氏酵母及其应用。所述菌株能够利用普通碳源和氮源，经高密度培养后，β‑胡萝卜素产量达到7.8g/L，含量达到161mg/g DCW，是高产β‑胡萝卜素的优良菌株。该工程菌株以将CarRP和CarB基因定点整合至zeta位点的低产β‑胡萝卜素解脂耶氏酵母菌株T1为出发菌，将内源关键酶HMGs、HMGCR、ERG20、GGS1、ERG8、ERG12、ERG19及IDI进行多轮随机整合，并引入外源GGPP合成酶GPS(可将IPP和DMAPP直接催化成GGPP)和血红蛋白VHb，最后对降低脂质体降解的关键基因AAL8进行敲除得到该高产菌株。作为一种β‑胡萝卜素生产工程菌，在食品、饲料、医药及化妆品领域具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一株高产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母及其应用
本专利技术属于工程菌
，具体涉及一株解脂耶氏酵母菌(Yarrowialipolytica)GVD-A，其构建方法、及所述菌株作为β-胡萝卜素生产工程菌的应用；本专利技术还包括上述菌株的菌剂，及在食品工业、饲料工业、医药及化妆品工业领域的应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。迄今为止，已报道了700多种类胡萝卜素，植物、细菌、藻类和酵母皆可是其来源，β-胡萝卜素是其中之一。β-胡萝卜素可作为维生素A的前体，是世界卫生组织和联合国粮农组织食品添加剂联合专家委员会认定的A类全营养食品强化剂，已被世界上52个国家和地区批准使用。β-胡萝卜素具有抗氧化、保护视力、抗衰老、抗肿瘤、抗骨质疏松、抗辐射、预防血管硬化和提高免疫力等许多重要的生理功能，在食品、药品、保健品等领域具有广阔的应用前景。目前β-胡萝卜素的生产方法主要有三种：化学合成法、植物提取法和微生物发酵法。化学合成法工艺流程复杂、能耗高、污染大；β-胡萝卜素在植物中含量通常很低，植物提取法对野生植物资源造成严重破坏；相比之下，微生物发酵法不受原料的限制、生产过程绿色清洁，具有很大的优势。目前微生物制备β-胡萝卜素，主要菌种有杜氏盐藻和三孢布拉氏霉。杜氏盐藻(Dunaliella)和三孢布拉氏霉(Blakesleatrispro)的发酵生产技术比较成熟，均已经进入工业化生产，其中三孢布拉氏霉培养5天β-胡萝卜素产量可达800～900mg/L，杜氏盐藻发酵β-胡萝卜素在干菌体中的含量可达10％。但是三孢布拉氏霉由于霉菌的生殖方式等原因，其性状易发生衰退，藻类养殖条件要求苛刻，这些不足限制了其发展。因此，提供一株易于发酵培养的高产β-胡萝卜素的菌株具有重要的现实意义。
技术实现思路
针对上述研究背景，本专利技术目的在于克服现有β-胡萝卜素生产菌株产量低的缺陷，旨在提供一种β-胡萝卜素的高产菌种。基于该目的，本专利技术以原本不产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母菌株(Yarrowialipolytica)作为出发菌株，将CarRP和CarB基因定点整合至zeta位点，以此低产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母菌株T1为出发菌，将内源关键限速酶进行多轮随机整合，并引入外源GGPP合成酶GPS和血红蛋白VHb，最后对脂质体降解的关键基因乙酰CoA连接酶AAL8进行敲除得到一种高产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)GVD-A，有望成为一种β-胡萝卜素生产的工程菌进行应用。基于上述研究结果，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术第一方面，提供一种β-胡萝卜素的工程菌，所述工程菌被修饰为与内源活性相比，具有增强的CarB、CarRP、GGPP合成酶GPS、血红蛋白VHb、GGS1及MVA途径相关酶活性，同时具有减弱的β-氧化酶活性。本专利技术效果较好的一种具体实施方式中，采用解脂耶氏酵母菌株(Yarrowialipolytica)作为出发菌株，经本专利技术方法修饰后获得解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)GVD-A，实现了高产β-胡萝卜素的效果。基于该技术效果，本专利技术第二方面，提供一株解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)GVD-A，所述菌株已于2020年10月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：中国武汉，武汉大学，其生物保藏号为：CCTCCNO:M2020595。优选的，所述菌株的形态学特征为：菌株呈丝状生长，菌体成深橙黄色，深橙黄色为积累在油滴中的β-胡萝卜素所致。本专利技术第三方面，提供第二方面所述解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)GVD-A作为β-胡萝卜素生产工程菌的应用。本专利技术第四方面，提供一种菌剂，所述菌剂包括第一方面所述的解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)GVD-A和/或所述菌的培养物。本专利技术第五方面，提供第二方面所述解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)GVD-A，和/或第四方面所述菌剂在食品工业、饲料工业、医药及化妆品工业领域的应用。本专利技术第六方面，提供第二方面所述解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)GVD-A的构建方法，以解脂耶氏酵母菌株(Yarrowialipolytica)作为出发菌株，制备所述解脂耶氏酵母菌株(Yarrowialipolytica)的潮霉素、尿嘧啶及亮氨酸营养缺陷型，所述营养缺陷型菌株中的β-氧化酶缺失，同时过表达CarB、CarRP、GGPP合成酶GPS、IDI、血红蛋白VHb、GGS1及MVA途径相关酶，最后对乙酰CoA连接酶AAL8进行敲除。基于本专利技术的研究结果，所述解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)GVD-A作为β-胡萝卜素的工程菌能够带来理想的产能，为了更好实现上述菌株的工业化应用，本专利技术进一步的，还对所述工程菌的发酵培养方法进行了研究，一方面提供了更为适合上述菌株的工业化连续发酵方法。另一方面，针对该发酵方法的研究表明，上述菌株在培养过程中对pH要求宽松，该特点可以有效的节约工业生产过程中，对培养液pH进行调节的步骤，进一步节约产能。因此，本专利技术第七方面，提供第一方面所述解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)GVD-A的发酵方法，所述发酵方法包括采用2XYPD、YPD培养基进行发酵培养。以上一个或多个技术方案的有益效果是：1、本专利技术提供了一种新的解脂耶氏酵母，可用于高产β-胡萝卜素，具有广泛的工业应用前景，属于同类技术的先进水平。2、本专利技术在构建工程菌株CCTCCNO:M2020595时涉及到三个新靶点(GPS，VHb和AAL8)的应用。3、本专利技术构建的解脂耶氏酵母β-胡萝卜素生产工程菌株进行β-胡萝卜素发酵无需对发酵液pH进行调节，减少人力和物力的消耗。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1为实施例1中所用到的质粒的结构图。图2为实施例2中过程菌株T1-G的6个转化子β-胡萝卜素产量图。图3为实施例2中过程菌株T1-GV的6个转化子β-胡萝卜素产量图。图4为实施例2中过程菌株T1-GVC的6个转化子β-胡萝卜素产量图。图5为实施例2中过程菌株T1-GVD的6个转化子β-胡萝卜素产量图。图6为实施例3中工程菌GVD-A摇瓶发酵β-胡萝卜素产量图。图7为实施例3中工程菌GVD-A上罐发酵β-胡萝卜素产量图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种β-胡萝卜素的工程菌，其特征在于，所述工程菌被修饰为与内源活性相比，具有增强的CarB、CarRP、GGPP合成酶GPS、血红蛋白VHb、GGS1及MVA途径相关酶活性，同时具有减弱的β-氧化酶活性。/n

【技术特征摘要】
1.一种β-胡萝卜素的工程菌，其特征在于，所述工程菌被修饰为与内源活性相比，具有增强的CarB、CarRP、GGPP合成酶GPS、血红蛋白VHb、GGS1及MVA途径相关酶活性，同时具有减弱的β-氧化酶活性。


2.如权利要求1所述制备β-胡萝卜素的工程菌，其特征在于，所述β-氧化酶为乙酰CoA连接酶8；
或，所述GGPP合成酶GPS来源于Archaeoglobus；
或，所述血红蛋白VHb来自Vitreoscilla；
或，所述番茄红素合成酶CarB来自Rhizomucorcircinelloides；
或，所述番茄红素环化酶CarRP来自Rhizomucorcircinelloides；
或，所述MVA激酶基为包括但不限于ERG8、ERG12、ERG19中一种或几种；或，所述IDI为IPP异构酶，所述基因序列号为NC_006072.1；
或，所述工程菌中，潮霉素、尿嘧啶及亮氨酸营养缺失；
或，所述工程菌为包括但不限于大肠杆菌、酵母菌；进一步的，所述酵母菌优选解脂耶氏酵母或酿酒酵母菌。


3.一株解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)GVD-A，所述菌株已于2020年10月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：中国武汉.武汉大学，其生物保藏号为：CCTCCNO:M2020595。


4.如权利要求3所述解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)GVD-A，其特征在于，所述菌株的种子培养基中，包括葡萄糖1～3％；蛋白胨1～3％；酵母提取物0.5～2％；或，所述菌株的发酵培养基中，包括葡萄糖8～12％；蛋白胨2～6％；酵母提取物1～3％。


5.权利要求3或4所述解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)GVD-A作为β-胡萝卜素生产工程菌的应用。


6.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求3或4所述的解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)GVD-A和/或所述菌的培养物。


7.权利要求3或4所述解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)GVD-A，和/或权利要求4所述菌剂在食品工业、饲料工业、医药及化妆品工业领域的应用。


8.权利要求3或4所述解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)GVD-A的构建方法，其特征在于，以解脂耶氏酵母菌株(Yarrowialipolytica)作为出发菌株，制备所述解脂耶氏酵母菌株(Yarrowialipolytica)的潮霉素、尿嘧啶及亮氨酸营养缺陷型，所述营养缺陷型菌株中的β-氧化酶缺失，...

【专利技术属性】
技术研发人员：祁庆生，侯进，刘萌萌，张瑾，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37