一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法，涉及诱变育种技术领域。本发明专利技术所述方法，将冷等离子体技术应用于结缕草体细胞诱变过程中，显著提高了结缕草的诱变频率，降低了育种成本，加快了结缕草育种进程，为其他植物体细胞诱变育种提供借鉴，具有绿色、高效、操作简单等优良特性，在生物诱变育种领域具有广泛的应用前景。利用本发明专利技术所述方法，变异频率较常规诱变育种显著提高，可达到19.1％。

【技术实现步骤摘要】
一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法
本专利技术属于诱变育种
，具体涉及一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法。
技术介绍
结缕草属(ZoysisWilld.)植物是禾本科画眉草亚科的多年生草本植物，是一种优良的暖季型草坪草和牧草，广泛应用于国内外暖温带到热带区域的园林绿化、运动场、固土护坡和盐碱地绿化草坪建植，具有重要的坪用、水土保持和饲用价值。然而结缕草生长速度缓慢严重阻碍了结缕草产业的发展。目前，结缕草新品种培育以系统选育、杂交育种为主，育种周期长效率低，严重阻碍了结缕草育种进程，如何快速选育速生优质品种一直是结缕草育种的科学难题。结缕草可育种子较少，种皮较厚，且营养体表皮也较厚，常规的方法很难达到良好的诱变效果。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法，所述方法成本低、安全环保、诱变效率高，在较短时间内可获得优良突变体。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法，包括以下步骤：(1)利用结缕草的幼嫩分蘖芽诱导体细胞组织，对诱导得到的体细胞组织进行冷等离子体诱变，得诱变体；所述冷等离子体诱变在真空条件下进行，且在进行诱变时通入放电气体氧气10～12min，压强为15～30Pa，处理功率为600～750W，诱变8～12min；(2)将所述诱变体依次进行分化培养和生根培养，得诱变植株；(3)对所述诱变植株进行表型和SRAP分子鉴定，得变异植株；对所述变异植株进行扦插繁殖，鉴定突变性状，获得稳定遗传的突变体。优选的，步骤(1)所述诱导包括将消毒后的幼嫩分蘖芽接种到诱导培养基中进行诱导，获得体细胞组织；所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：2,4-D6～8mg/L、L-脯氨酸4～5g/L、5-氨基乙酰丙酸5～7mg/L、VB12～3mg/L、蔗糖25～30g/L和植物凝胶3～5g/L。优选的，步骤(1)所述诱导在暗环境中进行，温度为25±1℃，诱导的时间为20～30d。优选的，所述消毒包括：用质量百分含量为15％的H2O2水溶液浸泡所述幼嫩分蘖芽10～15min，蒸馏水冲洗3～5min，然后用体积百分含量为50％的乙醇水溶液浸泡8～12min，蒸馏水冲洗10～15min。优选的，步骤(1)所述等离子体诱变时，取直径0.4～0.7cm的颗粒状体细胞组织，置于直径6cm的石英玻璃培养皿中，将培养皿置于射频放电两块极板中间，距电极板的距离为1～2cm。优选的，步骤(2)所述分化培养为暗培养，所述暗培养的温度为25±1℃，暗培养的时间为30d；所述分化培养用培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：NAA0.3～0.5mg/L、5-氨基乙酰丙酸1～3mg/L、蔗糖25～30g/L和植物凝胶3～5g/L。优选的，步骤(2)所述生根培养为光暗交替培养，光周期为12h/d，光照强度为2000～2500Lx，所述生根培养的温度为25±1℃，培养时间为10～15d；所述生根培养用培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：GR240.5～1.0μg/L、IBA0.1～0.2mg/L、蔗糖25～30g/L和植物凝胶3～5g/L。优选的，步骤(3)所述表型包括叶长、叶宽、节间长度、节间直径和草层高度。优选的，步骤(3)所述SRAP分子鉴定包括利用20对SRAP引物对对所述诱变植株与正常植株进行PCR扩增；所述20对SRAP引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.40所示。本专利技术提供了一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法，将冷等离子体技术应用于结缕草体细胞诱变过程中，显著提高了结缕草的诱变频率，降低了育种成本，加快了结缕草育种进程，为其他植物体细胞诱变育种提供借鉴，具有绿色、高效、操作简单等优良特性，在生物诱变育种领域具有广泛的应用前景。利用本专利技术所述方法，变异频率较常规诱变育种显著提高，可达到19.1％。与氦气冷等离子体相比，氧气冷等离子体放电产生的带电离子种类和活性粒子浓度增加，因此其诱变效果更佳。附图说明图1为实施例1～2中冷等离子体放电装置结构示意图；图2为野生型结缕草；图3为实施例1冷等离子体诱变创制的结缕草突变体及SARP分子标记结果图；图4为实施例2冷等离子体诱变创制的结缕草突变体及SARP分子标记结果图。具体实施方式本专利技术提供了一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法，包括以下步骤：(1)利用结缕草的幼嫩分蘖芽诱导体细胞组织，对诱导得到的体细胞组织进行冷等离子体诱变，得诱变体；所述冷等离子体诱变在真空条件下进行，且在进行诱变时通入放电气体氧气10～12min，压强为15～30Pa，处理功率为600～750W，诱变8～12min；(2)将所述诱变体依次进行分化培养和生根培养，得诱变植株；(3)对所述诱变植株进行表型和SRAP分子鉴定，得变异植株；对所述变异植株进行扦插繁殖，鉴定突变性状，获得稳定遗传的突变体。本专利技术利用结缕草的幼嫩分蘖芽诱导体细胞组织，对诱导得到的体细胞组织进行冷等离子体诱变，得诱变体；所述冷等离子体诱变在真空条件下进行，且在进行诱变时通入放电气体氧气10～12min，压强为15～30Pa，处理功率为600～750W，诱变8～12min。本专利技术所述诱导优选包括将消毒后的幼嫩分蘖芽接种到诱导培养基中进行诱导，获得体细胞组织；所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：2,4-D6～8mg/L、L-脯氨酸4～5g/L、5-氨基乙酰丙酸5～7mg/L、VB12～3mg/L、蔗糖25～30g/L和植物凝胶3～5g/L；所述诱导优选在暗环境中进行，温度为25±1℃，诱导的时间为30d。本专利技术在进行所述诱导前优选还包括消毒，所述消毒优选包括：用质量百分含量为15％的H2O2水溶液浸泡所述幼嫩分蘖芽15min，蒸馏水冲洗3～5min，然后用体积百分含量为50％的乙醇水溶液浸泡8min，蒸馏水冲洗10min。本专利技术所述幼嫩分蘖芽的长度优选为0.5～1cm。本专利技术所述诱导培养基中2,4-D具有诱导愈伤组织的作用，L-脯氨酸为愈伤组织诱导提供碳源且作为渗透调节物质保护细胞免受损伤，5-氨基乙酰丙酸可以促进生芽，VB1可以防止愈伤组织褐化，蔗糖可以提供碳源，植物凝胶可以固定支撑愈伤组织。本专利技术对所述诱导培养基中各原料的来源并没有特殊限定，优选为本领域的常规市售试剂。本专利技术在进行所述等离子体诱变时，优选取直径0.4～0.7cm的颗粒状体细胞组织，置于直径6cm的石英玻璃培养皿中，将培养皿置于射频放电两块极板中间，距电极板的距离为1～2cm，封闭反应体系，抽真空，通入放电气体10～12min，压强为15～30Pa，处理功率为600～750W，诱变8～12min。得诱变体后，本专利技术将所述诱变体依次进行分化培养和生根培养，得诱变植株。本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用结缕草的幼嫩分蘖芽诱导体细胞组织，对诱导的体细胞组织进行冷等离子体诱变，得诱变体；所述冷等离子体诱变在真空条件下进行，且在进行诱变时通入放电气体氧气10～12min，压强为15～30Pa，处理功率为600～750W，诱变8～12min；/n(2)将所述诱变体依次进行分化培养和生根培养，得诱变植株；/n(3)对所述诱变植株进行表型和SRAP分子鉴定，得变异植株；对所述变异植株进行扦插繁殖，鉴定突变性状，获得稳定遗传的突变体。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用结缕草的幼嫩分蘖芽诱导体细胞组织，对诱导的体细胞组织进行冷等离子体诱变，得诱变体；所述冷等离子体诱变在真空条件下进行，且在进行诱变时通入放电气体氧气10～12min，压强为15～30Pa，处理功率为600～750W，诱变8～12min；
(2)将所述诱变体依次进行分化培养和生根培养，得诱变植株；
(3)对所述诱变植株进行表型和SRAP分子鉴定，得变异植株；对所述变异植株进行扦插繁殖，鉴定突变性状，获得稳定遗传的突变体。


2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)所述诱导包括将消毒后的幼嫩分蘖芽接种到诱导培养基中进行诱导，获得体细胞组织；所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：2,4-D6～8mg/L、L-脯氨酸4～5g/L、5-氨基乙酰丙酸5～7mg/L、VB12～3mg/L、蔗糖25～30g/L和植物凝胶3～5g/L。


3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，步骤(1)所述诱导在暗环境中进行，温度为25±1℃，诱导的时间为20～30d。


4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述消毒包括：用质量百分含量为15％的H2O2水溶液浸泡所述幼嫩分蘖芽10～15min，蒸馏水冲洗3～5min，然后用体积百分含量为50％的乙醇水溶液浸泡8～12min，蒸馏水冲洗10～15min。

【专利技术属性】
技术研发人员：李玲，刘建秀，宗俊勤，王浩然，郭海林，郭爱桂，陈静波，李丹丹，李建建，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32