快速从窖泥中富集葡萄糖利用型产己酸菌群的方法及应用技术

本发明专利技术公开了快速从窖泥中富集葡萄糖利用型产己酸菌群的方法及应用，属于酿造微生物技术和生物技术领域。采用本发明专利技术所提供的一种提高窖泥中糖利用型己酸菌群丰度和产己酸能力的方法，得到糖利用型己酸菌群及其菌液，己酸产量呈持续上升趋势，经过连续传代，己酸产量由1.3g/L提升至9.5g/L；在富集过程中，能利用葡萄糖的己酸菌属微生物的相对丰度逐渐升高，由12％提升至43％。本发明专利技术技术可以用于白酒酸度和酯香风味提升，也可以应用于以葡萄糖为碳源的己酸发酵。为碳源的己酸发酵。为碳源的己酸发酵。

【技术实现步骤摘要】
快速从窖泥中富集葡萄糖利用型产己酸菌群的方法及应用


[0001]本专利技术涉及快速从窖泥中富集葡萄糖利用型产己酸菌群的方法及应用，属于酿造微生物


技术介绍

[0002]白酒是世界六大蒸馏酒之一，在长期的发展进程中，形成了多种香型的白酒。其中，浓香型白酒以其窖香浓郁、绵柔甘冽、香味协调、入口甜、落口绵、尾净余长的特点深受广大消费者的喜爱。在浓香型白酒生产中，窖泥是浓香型白酒酿造的基础，而窖泥质量很大程度上决定了白酒的品质。近年来对窖泥的理化测试分析表明，质量较优的窖泥在感官上呈现青灰色且具有较浓的酯香味，具有近中性的pH值(5.0～7.0)，较低的乳酸含量(<30g/kg)和较高的己酸含量(>6g/kg)。参考文献如下：
[0003]Hu,X.L.,Du,H.,Ren,C.,Xu,Y.,2016.Illuminating anaerobic microbial community and cooccurrence patterns across a quality gradient in Chinese liquor fermentation pit muds.Appl.Environ.Microbiol.82,2506
‑
2515。
[0004]Tao,Y.,Li,J.,Rui,J.,Xu,Z.,Zhou,Y.,Hu,X.,Wang,X.,Liu,M.,Li,D.,Li,X.,2014.Prokaryotic communities in pit mud from different
‑
aged cellars used for the production of Chinese Strong
‑
flavored liquor.Appl.Environ.Microbiol.80,2254
‑
2260。
[0005]己酸乙酯是浓香型白酒的关键特征风味物质，也是“窖香”的重要来源物质之一，该物质由己酸和乙醇经酯化作用合成。己酸由窖泥中的厌氧菌合成，是白酒酿造过程中重要的化合物，其对维持酒体口感的协调具有重要作用。
[0006]己酸菌是具有产己酸功能的厌氧菌统称，是窖泥中的重要功能微生物，其丰度、种类与窖泥质量密切相关。老熟的窖泥相比新窖泥往往含有丰度更高的己酸菌，老窖池中产出的浓香型白酒品质也更加优良。然而，窖泥的自然老熟耗时较长，通常需要20年以上。因此，将人工富集培养的窖泥产己酸菌群应用于培养新窖泥，对于加速窖泥老熟具有重要意义。
[0007]长期以来，研究人员致力于从老熟的窖泥中对己酸菌进行富集与分离，试图得到一种能够改善窖泥品质的混菌发酵液；在过去的研究中，研究人员认为窖泥中的己酸菌主要是利用乙醇合成己酸，因此多使用以乙醇为基础碳源的培养基对窖泥中的己酸菌进行富集与筛选，获得乙醇利用型己酸菌混菌体系；但是目前以乙醇为基础碳源的通用培养基对窖泥中的己酸菌富集效率较低，传代的稳定性较差，并且乙醇利用型己酸菌混菌体系的产己酸能力不高。
[0008]现有技术中，有通过向稀释窖泥中添加黄水、白酒酒糟处理混合物或两者混合物，每天进行进出料对窖泥中己酸功能菌进行富集，当驯化至己酸产量稳定时，菌群中Caproiciproducens属的丰度为25％，此技术方法虽能对窖泥中的己酸菌进行富集，但是富集得到的己酸菌丰度仍较低(记载于公开号为CN111440838A专利申请文本中)。
[0009]有文献表明，采用乳酸为碳源能够从窖泥中富集到产己酸能力较强的混菌(Zhu X,Tao Y,Liang C,Li X,Wei N,Zhang W,Zhou Y,Yang Y,Bo T.2015.The synthesis of n
‑
caproate from lactate:a new efficient process for medium
‑
chain carboxylates production.Sci Rep 5.)，然而该方法需要连续进出料90天，富集耗时较长，效率不够高。
[0010]新窖泥菌群在酿造过程中会发生自发演替，使菌群结构稳定，稳定的菌群富含以己酸菌群为主体的产酸菌群，成为酿造优质浓香型白酒的重要基础。但酿造过程的菌群自然演替过程长达20～30年，但能生产优质浓香型白酒的窖池较为稀有，造成浓香型白酒优质品率较低，行业优质品率普遍在20～30％之间。因而，从优质窖泥“复刻”优质产酸菌群，用于固态发酵过程产风味物质强化，是提高浓香型白酒优质品率的重要手段。另外一方面，随着浓香型白酒机械化、自动化酿造技术改造的深入，无泥类浓香型白酒技术研发也需要不依赖于窖泥的产酸菌群培养技术。
[0011]构建特定功能菌群具有两种方法，其中一种为“自下而上”(bottom
‑
up)构建方法，即分离获得纯培养微生物，再将纯培养微生物按照特定配比进行组合，构建出特定功能的菌群，该种菌群构建方法需要首先获得纯培养菌株。目前Caproiciproducens属下的大部分微生物尚未得到分离，且难于纯培养，显然，通过“自下而上”构建稳定产己酸菌群在现阶段存在较大的技术难题。另外一种构建特定功能菌群的方法为“自上而下”构建方法，即通过控制如底物类型与接种比例、培养温度、培养pH等环境因子，从自然环境中定向富集获得目标功能菌群。该方法无需先进行纯培养微生物分离，即可获得具有特定功能的菌群，相关理论参考文献如下：
[0012]Lawson CE,Harcombe WR,Hatzenpichler R,Lindemann SR,Loffler FE,O'Malley MA,Garcia Martin H,Pfleger BF,Raskin L,Venturelli OS,Weissbrodt DG,Noguera DR,McMahon KD.2019.Common principles and best practices for engineering microbiomes.Nature Reviews Microbiology 17:725
‑
741。
[0013]尽管“自上而下”菌群构建在理论上可行，但对于特定菌群功能，如窖泥产己酸菌群的构建，目前尚未发现能将产己酸表型维持在一定水平之上的技术手段。
[0014]专利技术人在前期研究中，通过窖泥产酸菌群发酵，对窖泥混菌发酵模拟体系的碳源选择、处理方式进行了探索，发现窖泥混菌可以直接利用葡萄糖产生含量可观的己酸，且该现象在不同产地浓香型酒厂窖泥中普遍存在。以葡萄糖为碳源的产酸菌群底物利用效率、菌体生长速率、己酸产量要明显优于乙醇碳源。发酵后期窖泥产孢混菌相比发酵前期的营养菌体，具有更加稳定的产己酸能力；并且研究发现添加乙酸钠、丁酸钠的培养基下混菌的产量明显要高于不添加电子受体的培养基下的己酸产量。但是，专利技术人课题组同时也发现，不同来源的窖泥厌氧产酸菌群的己酸合成能力参差本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速从窖泥中富集葡萄糖利用型产己酸菌群的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)配制富集培养基；(2)筛选合格窖泥：将窖泥接种于富集培养基进行培养，检测发酵终点富集培养液的己酸含量，判定己酸含量高于1.5g/L的富集培养体系所用的接种窖泥为合格窖泥；(3)将合格窖泥接种至富集培养基中进行逐级培养，每级种子液的培养时间为3d
‑
5d；所述富集培养基成分，按g/L，含有：葡萄糖10.0
‑
30.0，酵母粉5.0
‑
10.0，蛋白胨5.0
‑
10.0，磷酸氢二钾0.5
‑
1.0，磷酸二氢钾0.5
‑
1.0，硫酸铵1.0
‑
3.0，硫酸镁0.1
‑
0.5，电子受体2.5
‑
5.0，微量元素营养液：0.15
‑
1.0mL/L；所述电子受体为：乙酸钠、丁酸钠中的一种或两种。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中每级种子液按照体积分数为5％
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：任聪，徐岩，王慧琳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：