一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法技术

本发明专利技术公开了一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，该方法包含：毛竹幼胚愈伤组织的诱导、毛竹愈伤组织的增殖、转化载体pER8

【技术实现步骤摘要】
一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法


[0001]本专利技术涉及一种遗传转化的方法，具体涉及一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法。

技术介绍

[0002]竹子是重要的森林资源之一，具有分布广、生长快、用途多、生态和经济价值高等特点。竹子开花周期长，开花后死亡，杂交育种非常困难，缺乏生产上急需的优新品种。自上世纪80年代以来，已经对毛竹属(Phyllostachys)、牡竹属(Dendrocalamus Nees)、麻竹属(Dendrocalamus)、赤竹属(Sasa Makinoet Shibata)以及泰竹属(Thysostachys Gamble)等20余属70多个竹种不同的外植体和培养条件进行组织培养研究，获得了愈伤组织或丛生芽，并在一些竹种上诱导出了完整的再生植株。但是，目前竹子组织培养成功的报导中，90％集中于丛生竹种，且植株再生效率普遍较低。在麻竹中已有遗传转化的成功报道，但是仍然存在转化周期长和转化效率低等问题。
[0003]毛竹(Phyllostachys edulis)是大型散生竹种之一，是中国栽培悠久、面积最广、经本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，其特征在于，该方法包含：毛竹幼胚愈伤组织的诱导、毛竹愈伤组织的增殖、转化载体pER8
‑
WUS
‑
RdCodA的构建、农杆菌侵染、毛竹抗性愈伤组织的筛选与不定芽的分化、转基因植株再生与炼苗移栽和毛竹转基因再生植株检测；所述毛竹幼胚愈伤组织的诱导，包含：对未成熟毛竹种子灭菌后，将胚剥离于愈伤诱导培养基上，25
±
1℃暗培养，以诱导出愈伤组织；其中，所述愈伤诱导培养基的组分包含：MS培养基、2.0～6.0mg/L 2,4
‑
D、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH＝5.8；所述毛竹愈伤组织的增殖，包含：将所述愈伤组织转置于继代培养基中进行继代培养，25
±
1℃暗培养；其中，所述继代培养基的组分包含：MS培养基、0.1mg/L或1.0mg/L的2,4
‑
D、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH＝5.8；采用含0.1mg/L 2,4
‑
D的继代培养基和1.0mg/L 2,4
‑
D的继代培养基交替进行继代培养；所述转化载体pER8
‑
WUS
‑
RdCodA的构建，包含：将雌二醇诱导载体pER8进行Xho I/Spe I双酶切，以获得pER8线性化载体；在玉米WUS基因两端加入载体同源序列，并通过同源重组的方法将其插入pER8线性化载体中，获得重组载体pER8
‑
WUS；采用EcoR V对重组载体pER8
‑
WUS进行单酶切，获得载体片段；将Rd29A启动子诱导的CodA基因完整表达框插入经单酶切获得的pER8
‑
WUS载体片段的EcoRV位点，以构建转化载体pER8
‑
WUS
‑
RdCodA；所述农杆菌侵染，包含：将所述转化载体pER8
‑
WUS
‑
RdCodA通过电激法转化农杆菌感受态细胞EHA105，挑单克隆于含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YM培养基上划线，28
±
1℃培养；收集农杆菌菌体，将其悬浮于液体继代培养基中，不断晃动至菌体OD
600
为0.3～0.6，得到侵染液，在侵染液中添加乙酰丁香酮，乙酰丁香酮的浓度为100μmol/L；在侵染时，挑选白色愈伤组织加侵染液侵染，结束后吸干叶片上残留的侵染液，叶片移至共培养基上，在温度25
±
1℃，暗培养；其中，所述共培养基的组分包含：所述继代培养基和100μmol/L乙酰丁香酮；所述毛竹抗性愈伤组织的筛选与不定芽的分化，包含：将共培养后的愈伤组织转入筛选培养基，培养温度25
±
1℃，暗培养，将新长出的愈伤在筛选培养基上继代培养后转入分化培养基，培养条件为温度25
±
1℃，光照；其中，所述筛选培养基的组分包含：所述继代培养基、1～5μmol/L雌二醇、20mg/L潮霉素、300mg/L头孢霉素；所述分化培养基的组分包含：MS培养基、2.0mg/L 6
‑
BA、1.0mg/L KT、0.5mg/LNAA、20mg/L潮霉素、300mg/L头孢霉素、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH＝5.8；所述转基因植株再生与炼苗移栽，包含：选取健壮的不定芽，移入生根培养基，培养温度25
±
1℃，光照，待根系形成后将幼苗移入生长培养基，培养温度25
±
1℃，光照；待根系发达，苗长到5cm以上时进行移栽；其中，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔桂荣，卓仁英，黄碧芸，邱文敏，王雨珺，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院亚热带林业研究所，
类型：发明
国别省市：