一种高效钠升级液相色谱柱的分压填充方法技术

一种高效钠升级液相色谱柱的分压填充方法，解决了钠升级色谱柱价格昂贵，色谱柱的填充效率较低的问题。其包括如下步骤：a)准备聚酰亚胺石英毛细管一根；b)采用拉针仪将聚酰亚胺石英毛细管一端拉细至5um，拉出的聚酰亚胺石英毛细管的针尖平滑；c)色谱柱填充；d)聚酰亚胺石英毛细管色谱柱针尖处理；e)色谱柱组装，将聚酰亚胺石英毛细管色谱柱与四通阀完成组装；f)填充液置换，利用钠升级液相色谱，将填充色谱柱的甲醇利用流动相进行置换后置于洁净干燥处保存。本发明专利技术填充钠升级色谱柱的成本在80元-150元之间，极大程度上降低了成本，且分离效率较高。分离效率较高。分离效率较高。

【技术实现步骤摘要】
一种高效钠升级液相色谱柱的分压填充方法


[0001]本专利技术涉及液相色谱柱填充
，尤其是涉及一种高效钠升级液相色谱柱的分压填充方法。

技术介绍

[0002]钠升级液相色谱与高分辨质谱联用是目前蛋白组学常用的技术手段。其中色谱柱的柱效是决定蛋白鉴定质量的一个关键指标。目前商业化的钠升级色谱柱技术成熟。但由于不同实验的需求以及蛋白制样技术的不同，对于色谱柱的填料以及填充方法的多样性提出了新的要求。蛋白组学实验样品群体大，色谱柱稳定性以及连续性至关重要，因此在可控范围内保证自天柱的经济性以及填充效果效率是必要的。现在市场上商品化钠升级色谱柱价格大多在8000元～12000元一根。

技术实现思路

[0003]针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本专利技术提供一种高效钠升级液相色谱柱的分压填充方法，有效的解决了钠升级色谱柱柱价格昂贵，色谱柱的填充效率较低的问题。
[0004]为实现上述目的，本专利技术包括如下步骤：a)准备聚酰亚胺石英毛细管一根；
[0005]b)采用拉针仪将聚酰亚胺石英毛细管一端拉细至5um，拉出的聚酰亚胺石英毛细管的针尖平滑；
[0006]c)色谱柱填充，1、利用甲醇混合色谱柱填料(以C18填料为例)，2、连接填充装置，将拉制好的聚酰亚胺石英毛细管色谱柱固定在填充装置上，3、分压填充设置：观察聚酰亚胺石英毛细管针尖悬浊液外溢状态，确保针尖正常无破损，填充开始时，设定压力值4MPa，填充在聚酰亚胺石英毛细管全柱长的1/3时，设定压力值4.2MPa，填充在全柱长的2/3时，设定压力值4.5MPa，直至填充完毕，填充完毕后，关掉氮气阀，待填充装置自动泄压后取下聚酰亚胺石英毛线管色谱柱；
[0007]d)聚酰亚胺石英毛细管色谱柱针尖处理，利用乙腈浸泡聚酰亚胺石英毛细管色谱柱针尖30分钟，取出浸泡好的聚酰亚胺石英毛细管色谱柱的针尖，用无尘纸擦洗干净；
[0008]e)色谱柱组装，将聚酰亚胺石英毛细管色谱柱与四通阀完成组装；
[0009]f)填充液置换，利用钠升级液相色谱，将填充色谱柱的甲醇利用流动相进行置换后置于洁净干燥处保存。
[0010]聚酰亚胺石英毛细管本专利技术填充钠升级色谱柱的成本在80元-150元之间，极大程度上降低了成本，且分离效率较高，与质谱联用时离子化效率高。
附图说明
[0011]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：
[0012]图1为本专利技术透视镜下观察的针尖效果。
[0013]图2为本专利技术色谱组装示意图。
[0014]图3为本专利技术色谱柱柱效检测示意图
具体实施方式
[0015]下面结合附图1-3对本专利技术的具体实施方式做进一步详细说明。
[0016]由图1-3可知，本专利技术包括如下步骤：a)准备聚酰亚胺石英毛细管一根；
[0017]目前常用的聚酰亚胺石英毛细管的规格为外径360um，内径有75um、100um、150um三种规格。
[0018]b)采用拉针仪将聚酰亚胺石英毛细管一端拉细至5um，拉出的聚酰亚胺石英毛细管的针尖平滑；
[0019]如图1所示，拉制后的聚酰亚胺石英毛细管的针尖平滑，其针尖端拉细至5um左右，针尖的形状决定着液相色谱质谱联用时的离子化效率，本专利技术中采用的拉针仪为SUTTER公司的P-2000拉针仪。
[0020]拉针仪拉制聚酰亚胺石英毛细管采用多次循环，循环1：加热指数400℃，电压值25V，延迟时间200S；
[0021]循环2，加热指数390℃，电压值15V，延迟时间200S
[0022]循环3，加热指数390℃，电压值15V，延迟时间200S；
[0023]循环4，加热指数400℃，电压值20V，延迟时间200S；
[0024]循环5，加热知识410℃，电压值15V，延迟时间110S，拉力值240N。
[0025]拉针仪的方法设定影响拉针效果，此参数经多次试验得出，拉出的聚酰亚胺石英毛细管针尖平滑，易于填充且在液相色谱与质谱联用时离子化效率高。
[0026]c)色谱柱填充，1、利用甲醇混合色谱柱填料(以C18填料为例)，2、连接填充装置，将拉制好的聚酰亚胺石英毛细管色谱柱固定在填充装置上，3、分压填充设置：观察聚酰亚胺石英毛细管针尖悬浊液外溢状态，确保针尖正常无破损，填充开始时，设定压力值4MPa，填充在聚酰亚胺石英毛细管全柱长的1/3时，设定压力值4.2MPa，填充在全柱长的2/3时，设定压力值4.5MPa，直至填充完毕，填充完毕后，关掉氮气阀，待填充装置自动泄压后取下聚酰亚胺毛线管色谱柱；
[0027]填充装置为现有的技术，现在有很多的填充装置，都可以使用本方法，本申请中以C18填料为例进行说明，填充装置利用磁力搅拌器不断搅拌得到C18填料的C18甲醇混合悬浊液，高压氮气将混匀的填料甲醇悬液压入聚酰亚胺石英毛细管色谱柱，针尖可保证填料无法外泄。
[0028]d)聚酰亚胺石英毛细管色谱柱针尖处理，利用乙腈浸泡聚酰亚胺石英毛细管色谱柱针尖30分钟，取出浸泡好的聚酰亚胺石英毛细管色谱柱的针尖，用无尘纸擦洗干净；
[0029]e)色谱柱组装，将聚酰亚胺石英毛细管色谱柱与四通阀完成组装；
[0030]色谱柱的组装如图2所示，其包括HPLC泵、自动加样器、预柱、四通阀、聚酰亚胺石英毛细管(作为分析柱)、穴通转向阀等，利用带加电端的360um四通阀完成组装，也可以用1/32英寸内径的四通阀加1/32转360um套管完成组装，
[0031]f)填充液置换，利用钠升级液相色谱，将填充色谱柱的甲醇利用流动相进行置换后置于洁净干燥处保存；
[0032]g)色谱柱柱效检测
[0033]在赛默飞Q Exactive Plus液相色谱质谱联用仪上连接填充好的聚酰亚胺石英毛细管柱。流动相：A相为含有0.1％甲酸的纯水；B相为含有10％纯水的乙腈，并加有0.1％的甲酸。流速为300nl/min，洗脱梯度见下表。色谱流出样品直接通过HESI离子源进入质谱。液相色谱进样量1ul。
[0034]色谱洗脱梯度
[0035][0036]纳升级液相色谱分离后的多肽组分进入质谱进行检测分析。主要质谱参数：离子源电压2KV；质谱采集模式为正离子模式；一级质谱采集分子量范围350～2000m/z；分辨率70000；最大离子注入时间20ms；二级质谱采集分辨率17500；最大离子注入时间50ms；TopN设定为20；碎裂能量设定为27eV。
[0037]在开放的蛋白数据库网站Uniport(http://www.uniprot.org/)上查找人类全蛋白(BSA)的蛋白序列，并以FSATA格式进行下载[11]。导入到Proteome Discoverer 2.1 SP1软件中进行蛋白数据库检索。检索参数设定：比对多肽质量范围350Da-5000Da；信噪比(S/N)&本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效钠升级液相色谱柱的分压填充方法，其特征在于，包括如下步骤：a)准备聚酰亚胺石英毛细管一根；b)采用拉针仪，将聚酰亚胺石英毛细管一端拉细至5um，拉出的聚酰亚胺石英毛细管的针尖平滑；c)色谱柱填充，1、利用甲醇混合色谱柱填料(以C18填料为例)，2、连接填充装置，将拉制好的聚酰亚胺石英毛细管固定在填充装置上，3、分压填充设置：观察聚酰亚胺石英毛细管针尖悬浊液外溢状态，确保针尖正常无破损，填充开始时，设定压力值4MPa，填充在聚酰亚胺石英毛细管全柱长的1/3时，设定压力值4.2MPa，填充在全柱长的2/3时，设定压力值4.5MPa，直至填充完毕，填充完毕后，关掉氮气阀，待填充装置自动泄压后取下聚酰亚胺毛线管色谱柱；d)聚酰亚胺石英毛细管色谱柱针尖处理，利用乙腈浸泡聚酰亚胺...

【专利技术属性】
技术研发人员：万建，汪兵，万翠红，李兵，周权，熊国梅，阮君，龚思颖，
申请(专利权)人：华中师范大学，
类型：发明
国别省市：