RNAi潜能的预测方法技术

本发明专利技术提供产生用于预测ＲＮＡｉ试剂的ＲＮＡｉ潜能的算法的方法。本发明专利技术还提供使用此种算法预测ＲＮＡｉ试剂的ＲＮＡｉ潜能的方法和抑制给定靶基因表达的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
自从Elbashir等证明了合成的小干扰RNA(siRNA)通过RNA干扰(RNAi)机制介导哺乳动物细胞中特异mRNA下调的能力[见例如Elbashir等，Nature，第411卷，第494-498页(2001)；和Caplen等，PNAS，第98卷，第17期，第9742-9747页(2001)]，该技术已经日益用作一种研究工具以通过研究特定基因特异下调所诱导的表型来研究基因功能。具体而言，由于以siRNA或RNA干扰类型试剂的方式进行的基因沉默实验仅仅需要知道靶基因的部分核苷酸序列，可以预计一旦已知特定生物的基因组就能够设计针对每一基因的RNAi实验和筛选与例如治疗靶点发现相关的表型。该基因组范围的方法指定了用于RNAi试剂设计的规范。的确，避免非靶标沉默的特异性参数变得特别重要。同样，单个siRNA潜能的特征不再是可以预期的。因此，需要有效的预测算法以便应用于RNA基因沉默实验以进行基因组范围的表型筛选。已经表明，与反义相似，靶标的可接近性在siRNA潜能中起着重要作用。见Kretschmer-Kazemi等，Nucleic Acids Res.，第31卷，第15期，第4417-4424页(2003)。最近，另一项研究[见Anastasia Khvorova，Cell，第115卷，第209-216页(2003)]显示，在激发siRNA和miRNA潜能中有一些序列需求，例如在反义链的5’以及在反义链区域9-14中dsRNA具有显著低的内部稳定性。这些发现是通过对siRNA潜能和双链体内部热动力学稳定性之间的相互关系进行统计学分析得到的。该研究基于针对3个不同靶标的375个随机选择siRNA的siRNA潜能。考虑到RNAi机制没有完全被表征以及许多额外参数会影响siRNA潜能的这种事实，获得更大的功能数据集以便更好地理解序列-活性相互关系是有益的。专利技术概述在一个方面，本专利技术涉及产生用于预测RNAi试剂的RNAi潜能的算法的方法，其包括a)实验确定多个RNAi试剂下调报道基因蛋白质读数(readout)的潜能；和b)使用所述潜能数据集训练人工神经网络。在另一个方面，本专利技术涉及通过本专利技术的方法所得到的算法。在另一个方面，本专利技术涉及用于预测RNAi试剂的RNAi潜能的方法，其包括a)提供多个包含与给定靶基因互补的区域的RNAi试剂序列；b)将根据本专利技术所训练的人工神经网络应用于所述RNAi试剂序列；和c)选择经预测有效的RNAi试剂序列。在另一方面，本专利技术涉及抑制给定靶基因表达的方法，其包括a)提供多个包含与给定靶基因互补的区域的RNAi试剂序列；b)将根据本专利技术所训练的人工神经网络应用于所述RNAi试剂序列；c)选择经预测有效的RNAi试剂序列；d)合成在c)中所选择的RNAi试剂；e)将表达靶基因的细胞暴露于d)的RNAi试剂；和f)测量RNAi试剂的活性或者测量通过下调靶基因所诱导的其它表型。附图简述附图说明图1归一化数据集实例。将靶向YFP mRNA 3’-UTR插入序列的79个siRNA与报道基因融合mRNA共转染(H1299，50nM，在50小时读数)。灰色柱是靶向3’-UTR的siRNA，黑色柱为阳性对照和阴性对照。将阴性对照任意设定成具有10％潜能并且将阳性对照设定成具有90％潜能。每个siRNA的潜能按照这些对照进行归一化。图2图解说明筛选数据的过滤。图3训练集的预测值与筛选测量值之间的比较。图4检验集的预测值与筛选测量值之间的比较。图5预测-测量相关性(关于检验集)对训练集大小的依赖性。专利技术详述文中引用的全部专利申请、专利和参考文献在此整体引用作为参考。如文中所使用，术语“RNAi试剂”和“寡核糖核苷酸”可互换使用并且意思是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚体或多聚体。RNAi试剂还可以包含修饰的核糖核苷酸残基。适宜的修饰是本领域已知的。见例如Uhlmann，Current Opin.Drug Discovery Dev.，第3卷，第2期，第203-213页(2000)；以及Uhlmann和Peyman，Chem.Rev.，Washington，DC，第90卷，第4期，第543-584页(1990)。术语RNAi试剂包括单链和双链核酸分子。双链核酸分子可以由两条独立链组成或者由这样的一条链组成，其中所述的一条链包含能够形成双链结构的两个区域和形成发夹环的两个区域间的间隔区。在RNAi情况下，RNAi试剂优选为双链结构并包含与靶基因互补的序列，无论如何，本专利技术不限制于双链结构并且还包括能够诱导RNAi的单链RNAi试剂。见Schwarz等，Mol.Cell，第10卷，第3期，第537-548页(2002)。在第一个方面，本专利技术提供产生用于预测RNAi试剂的RNAi潜能的算法的方法，其包括a)实验确定多个RNAi试剂下调报道基因蛋白质读数的潜能；和b)使用所述潜能数据集训练人工神经网络。在一个实施方案中，产生用于预测RNAi试剂的RNAi潜能的算法的方法包括步骤a)实验确定包含与至少一个靶基因互补的序列的多个RNAi试剂的RNAi潜能；b)用a)中实验确定的RNAi潜能产生所述RNAi试剂潜能的数据集，其中尽管所述数据集是从不同靶标(报道基因融合-mRNA)获得的，但是它们具有能够通过报道基因特异阳性对照和阴性对照进行归一化的标准蛋白质读数；和c)使用所述读数训练人工神经网络。在本专利技术的上下文中，术语算法意思是指一组方程和一组规则，它们能够自动应用于数据并且能够作为计算机可执行代码实现。“RNAi潜能”或“潜能”是本领域的术语并且意思是指特定siRNA一旦在细胞测定中转染其可以下调特定蛋白质或mRNA的相对能力。一般地，通过测量靶mRNA或蛋白质表达水平确定siRNA的潜能并且通常表示为阴性对照的百分数。因此，高潜能意思是指RNAi试剂能够有效地抑制(即降低)靶基因的表达，而低潜能意思是指靶基因的表达不被抑制或仅受到很小抑制。与阴性对照相比，有效RNAi试剂抑制靶基因的表达大于50％，优选大于60％、大于70％、大于80％，最优选大于90％。本专利技术的RNAi试剂是适宜用于RNAi实验的RNAi试剂。适宜RNAi的各种类型RNAi试剂是本领域已知的。见Dykxhoorn等，Nature Rev.，第4卷，第457-467页(2003)。此种RNAi试剂包含与靶基因互补的序列。在本专利技术上下文中，与靶基因互补意思是指序列与从靶基因DNA序列转录得到的RNA(包括前mRNA、mRNA、cDNA)互补。术语“靶基因”意思是包括被表达(即在细胞、组织或生物体中被转录成为RNA)的任何DNA序列。表达的序列不是必须要翻译成蛋白质，并且其还包括例如前mRNA、调节RNA、rRNA等等。与靶基因互补的序列一般长度为大约19-23个核苷酸，但是还可以更长。优选地，互补序列长度少于50个核苷酸，更加优选为15-35个核苷酸或18-25个核苷酸。互补序列优选为与靶基因的相应序列100％相同，即互补序列和靶基因的相应序列之间没有错配。在一些实施方案中，如果错配不削除RNAi试剂的RNAi活性的话，则互补序列可以包含1个、2个、3个、4个、5个或多个错配。用于RNAi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生用于预测ＲＮＡｉ试剂的ＲＮＡｉ潜能的算法的方法，其包括：ａ）实验确定包含与至少一个靶基因互补的序列的多个ＲＮＡｉ试剂的ＲＮＡｉ潜能；和ｂ）用所述数据集训练人工神经网络。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2003-12-10 60/528,4301.一种产生用于预测RNAi试剂的RNAi潜能的算法的方法，其包括a)实验确定包含与至少一个靶基因互补的序列的多个RNAi试剂的RNAi潜能；和b)用所述数据集训练人工神经网络。2.根据权利要求1所述的方法，其中RNAi潜能通过测定靶基因所编码蛋白质的数量来确定。3.根据前述权利中要求任意一项所述的方法，其中RNAi潜能通过报道基因测定法确定。4.根据前述权利中要求任意一项所述的方法，其中RNAi试剂被靶向至编码报道基因蛋白质的融合mRNA的3’UTR。5.根据前述权利中要求任意一项所述的方法，其中将来自不同融合mRNA的数据进行归一化。6.根据前述权利中要求任意一项所述的方法，其中确定至少100个RNAi试剂、优选至少1000个RNAi试剂的潜能。7.根据前述权利中要求任意一项所述的方法，其中所述RNAi试剂的序列是随机选择的。8.根据前述权利中要求任意一项所述的方法，其中所述RNAi试剂的序列具有与靶mRNA充分互补以致于结合靶mRNA的长度为15和30个核苷酸之间的区域。9.根据前述权利中要求任意一项所述的方法，其中RNAi试剂的互补区域...

【专利技术属性】
技术研发人员：J哈尔，D许斯肯，JB兰格，FJC纳特，MWHM莱因哈德，
申请(专利权)人：诺瓦提斯公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]