制备GLY-Tβ4的方法技术

本发明专利技术涉及甘氨酸

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备GLY
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T
β
4的方法


[0001]本专利技术涉及一种制备甘氨酸
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胸腺素β4(Gly
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Tβ4)的方法，更具体地说，涉及一种制备Gly
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Tβ4的方法，其包括表达作为Gly
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Tβ4的前体的GST融合重组人胸腺素β4(以下称为“GST
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Tβ4”)的表达工艺和Gly
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Tβ4纯化工艺。

技术介绍

[0002]大规模蛋白质纯化是在生物技术工业中变得越来越重要的问题。通常，通过使用哺乳动物或细菌细胞系通过细胞培养来生产蛋白质，哺乳动物或细菌细胞系经工程改造以通过插入含有靶蛋白基因的重组质粒来生产靶蛋白。由于本文使用的细胞系是活生物体，包含糖类，氨基酸和生长因子的复合培养基将提供给细胞，所述复合培养基通常由动物血清制剂提供。从提供给细胞的化合物和由细胞产生的副产物的混合物中分离出足够纯度的所需蛋白质以用于人类治疗是非常困难的。
[0003]但是，对于如蛋白质之类的生物制剂用作药物的情况，杂质的去除以及产品的产量非常重要。与工艺有关的杂质和与产品有关的杂质可能会有所不同。与工艺有关的杂质包含宿主细胞成分，例如蛋白质和核酸，并且源自细胞培养物(例如，培养基组分)或后处理工艺(例如，盐或分离的色谱配体)。与产品有关的杂质是具有不同性质的产物的分子变体。例如，此类分子变体包括通过脱氨基、不正确的糖基化或错配的二硫键以及缩短的形式例如前体和水解降解产物产生的修饰形式。与产品有关的变体还包括聚合物和聚集体。术语“污染物”用于表示具有化学、生物化学或微生物学特征的任何材料，这些材料不直接参与制备工艺。污染物包括可能不希望出现在细胞培养物中的病毒。
[0004]在生物制剂的情况下，杂质和污染物会引起安全问题。在生物制剂的情况下，这种情况经常发生，例如，如果通过注射或输液将治疗性蛋白质直接施用到血液中，可能会很严重。因此，宿主细胞组分可引起变态反应或免疫病理作用。此外，杂质可能导致所施用蛋白质的不希望的免疫原性，这会触发患者对治疗的不希望的免疫反应，例如导致致命的过敏性休克。因此，需要一种合适的纯化方法，该方法可以将所有不希望的物质去除到微不足道的水平。
[0005]同时，在生物制剂的情况下，经济方面不可忽视。因此，所使用的生产和纯化方法不应威胁所生产的生物制剂的经济可行性。此外，能够建立新的纯化方法所用的时间的测量也起着重要的作用。也就是说，除了成本效应外，工艺开发还需要与药物的临床前和临床开发相协调。因此，例如，只有在有足够纯度的的生物制剂以足够数量可用时才能启动某些临床前试验和所有临床试验。
[0006]从细胞碎片中纯化蛋白质的方法最初取决于蛋白质的表达位点。一种蛋白质可以直接从细胞分泌到周围的增殖培养基中，另一种蛋白质可以在细胞内产生。对于后一种蛋白质，纯化方法的第一步包括细胞裂解步骤，可以通过各种方法进行，包括机械剪切，渗透压冲击或酶处理。由于这种细胞裂解，整个细胞内含物被释放到细胞悬液中，并且产生由于其小尺寸而难以去除的细胞内片段。这些细胞内片段通常通过分级离心或过滤除去。在自
然细胞死亡和蛋白质产生过程中，由于宿主细胞蛋白质在细胞中的释放而直接分泌的蛋白质中也出现了这个问题，程度比上述情况要小。
[0007]当获得含有靶蛋白的纯化溶液时，将靶蛋白与细胞产生的另一种蛋白质的分离通常通过不同的色谱技术的组合来进行。这种色谱技术的关键在于，由于蛋白质可以不同的速度沿色谱柱向下移动，因此蛋白质可能会越来越多地被物理分离，或者选择性地粘附到分离介质上，从而被不同的溶剂差异洗脱。在某些情况下，当杂质特异性附着在色谱柱上，而靶蛋白未附着在色谱柱上时(即存在于流通液中)，靶蛋白就会从杂质中分离出来，或者当靶蛋白特异性附着在色谱柱上，附着的靶蛋白可以通过洗脱与杂质分离。已知可用于该步骤的多种柱色谱方法和材料。但是，随着替代方法数量的增加，就纯化效果、产量、生物活性、时间和成本而言，需要进行大量的初步试验来确定最佳的材料和方法。
[0008]此外，在纯化方法的建立和优化中，很明显，必须根据要纯化的特定分子(靶分子或靶蛋白)和生物起始材料的生物化学和生物物理特性分别对方法进行调整。从其分离靶材料的生物起始材料通常由非常复杂的材料的混合物形成。为了分离和浓缩靶分子，使用了特定的特征，例如形状、大小、溶解度、表面电荷、表面疏水性和对结合伴侣的生物特异性亲和力。对于新的目标分子，即，即使对于仅在先前步骤之一中发生了变化的相同目标分子(例如，发酵培养基的组成的变化)，也必须重新调整纯化工艺，因为在新条件下从上述方面可能无法实现最佳结果。
[0009]同时，理论上可以估计的替代工艺的数量取决于上面列出的参数的数量。在柱色谱中，例如，在整个工艺中，一系列色谱步骤、柱材料、pH、盐含量和所使用的各种洗脱缓冲液的性质，装入柱中时的蛋白质浓度以及其他方面需要优化。这使得不可能在工业规模上在适当的成本和时间范围内开发最佳的柱色谱工艺。同时，经济上的可行性和与设备相关的限制(例如，使用尽可能少种类的缓冲液，最小量或最小体积的缓冲液和色谱材料的必要性，保持包含产物的级分(fraction)体积尽可能小的必要性以及最短处理时间和最少废水体积的必要性)在每个工艺步骤中都需要优化。
[0010]因此，可以快速且低成本地建立和优化生物分子的柱色谱纯化方法，并且仍然迫切需要在大规模生产和纯化条件下获得令人满意的结果的工艺。
[0011]然而，甘氨酸
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胸腺素β4(Gly
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Tβ4)是由44个氨基酸的序列表示的肽，并且具有添加到常规胸腺素β4(Tβ4)的N末端的甘氨酸(Gly)。Gly
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Tβ4是通过对Tβ4的已知四级结构分析和蛋白质N末端的基因工程修饰而发现的，其具有与原始Tβ4不同的活性。Tβ4的结构和功能是相对定义的，并且Tβ4是已知的主要胸腺因子之一。已知Tβ4是从牛乳腺中提取的胸腺素级分5(TF5)中第一个分离的多肽，它具有43个氨基酸，分子量为4963KD，无二硫键和糖基化(The Journal of Biological Chemistry，第257卷，第2期，第1000
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1006页，1982，Chemical Characterization of Thymosin beta)。
[0012]通过在经操纵以表达常规Gly
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Tβ4的细菌细胞中发酵来表达和纯化Gly
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Tβ4，获得了Gly
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Tβ4。然而，已经指出，纯化中损失了大量蛋白质，并且通过上述工艺获得的Gly
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Tβ4最终具有较低的生产率。此外，当根据由中国北京的诺思兰德生物技术股份有限公司(Northland Biotech)制造(以下称为“NR培养方法”)的常规的30L培养批次记录发酵GST
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Tβ4时，也指出存在诸如形成培养基沉淀物和乙酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备甘氨酸
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胸腺素β4（Gly
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胸腺素β4，Gly
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Tβ4）的方法，包括：（S1）将样品加载到用平衡缓冲液平衡的一级阴离子交换色谱柱中，用洗涤缓冲液洗涤所述柱，并用洗脱缓冲液洗脱附着在所述柱上的级分；（S2）对洗脱物进行亲和色谱；（S3）通过凝血酶处理酶切洗脱物；（S4）将裂解产物加载到用平衡缓冲液平衡的二级阴离子交换色谱柱中，用洗涤缓冲液洗涤所述柱，并用洗脱缓冲液以3mg/mL或更少的动态结合能力（DBC）洗脱附着于所述柱的级分；（S5）将洗脱物加载到用平衡缓冲液平衡的阳离子交换色谱柱上，用洗涤缓冲液洗涤所述柱，并用洗脱缓冲液以3至8 mg/mL的DBC洗脱附着于所述柱的级分；和（S6）过滤洗脱物。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤（S4）中，将裂解产物在pH 8至9和电导率为4mS/cm或更小的条件下加载到柱中。3. 根据权利要求1所述的方法，其中，用pH 7至9的缓冲液洗脱附着至步骤（S4）中阴离子交换色谱中柱的级分，所述缓冲液包含10至30mM Tris
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HCl和30至130mM NaCl，流速为100至300 cm/小时。4. 根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤（S5）中，将洗脱产物以pH 4.5
±
0.1和2

【专利技术属性】
技术研发人员：金渶睦，张道水，姜锡瓒，金完燮，严基安，
申请(专利权)人：汇恩斯株式会社，
类型：发明
国别省市：