电致化学发光黄曲霉毒素生物传感器的制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种电致化学发光黄曲霉毒素生物传感器的制备方法及应用，包括：依次使用1.0μm、0.1μm和0.05μm的氧化铝浆料抛光，然后将电极分别在乙醇和超纯水中超声处理60s；将2.5～5μL的g‑CN‑APTAMER/BSA滴到处理后的电极上，并在氮气中于室温下干燥；将干燥后的电极用PBS洗涤3次后于4℃冰箱中保存晾干后，即得到电致化学发光黄曲霉毒素生物传感器。本发明专利技术方法得到的电致化学发光黄曲霉毒素生物传感器可以用于对黄曲霉毒素的快速、灵敏的检测。

【技术实现步骤摘要】
电致化学发光黄曲霉毒素生物传感器的制备方法及应用
本专利技术涉及新型纳米功能材料与电化学生物传感
，尤其涉及一种电致化学发光黄曲霉毒素生物传感器的制备方法及应用。
技术介绍
黄曲霉毒素是由曲霉属真菌产生的一类致癌真菌毒素，黄曲霉毒素B1是其中最致癌的物质，黄曲霉毒素B1可以引起肝细胞癌以及营养不良，生长障碍和免疫疾病，严重时甚至可以导致死亡。黄曲霉毒素广泛存在于土壤中，污染了许多农作物，如花生，玉米和水稻，家庭自制的发酵产品也能产生黄曲霉毒素，而且高温高湿地区的粮油及制品中黄曲霉毒素的检出率更高。目前，常用的黄曲霉毒素检测方法主要包括薄层色谱，液相色谱，气相色谱，液相色谱-质谱和免疫化学方法。尽管这些色谱方法具有安全性和敏感性，但它们却存在着一个极大的缺点就是使用仪器的昂贵、复杂的预处理和专人的检测培训。免疫化学可以简化加工过程并且节省时间，但是抗体在稳定性和成本上受到限制。因此，研发出一种成本低、检测快、灵敏度高、特异性强的黄曲霉毒素传感器具有重要意义。探索检测痕量黄曲霉毒素的新方法促进了光致发光，化学发光和电致化学发光的发展。电致化学发光能够控制发光反应的时间和位置，这意味着其重现性会更好。而且，它具有无背景信号、高灵敏度、线性范围宽的优点。在最优条件下分析物的浓度变化会影响光信号的大小，再利用生物免疫结合，就可以根据光信号的变化实现对分析物的定性定量分析。因此，基于电致化学发光的黄曲霉毒素B1痕量检测方法具有很高的价值。
技术实现思路
本专利技术提供了一种电致化学发光黄曲霉毒素生物传感器的制备方法及应用，以用于对黄曲霉毒素的快速、灵敏的检测。为了实现上述目的，本专利技术采取了如下技术方案。本专利技术实施例提供了一种电致化学发光黄曲霉毒素生物传感器的制备方法，包括如下步骤：11)依次使用1.0μm、0.1μm和0.05μm的氧化铝浆料抛光，然后将所述电极分别在乙醇和超纯水中超声处理60s；12)将2.5～5μL的g-CN-APTAMER/BSA滴到处理后的电极上，并在氮气中于室温下干燥；13)将干燥后的电极用PBS洗涤3次后于4℃冰箱中保存晾干后，即得到电致化学发光黄曲霉毒素生物传感器。优选地，g-CN-APTAMER/BSA的制备方法步骤如下：21)将羧基化g-CN溶于PBS溶液中获取0.01mg/mL的溶液，向1-2份所述溶液中依次加入1-2份浓度为40mmol/L的EDC和1份浓度为10mmol/L的NHS活化，搅拌0.5h-2h，得到混合物；22)将1份0.4-1μΜ的APTAMER加入所述混合物中，并在4℃下孵育0.5h-1h；23)将1份BSA溶液添加到孵育后的混合物中以封闭非特异性位点，并且在混合后静置1h-2h；24)将静置后的混合溶液离心并用0.01M的PBS洗涤超声得到均一的g-CN-APTAMER/BSA溶液；优选地，羧基化g-CN的制备方法为：31)将10-30份的尿素放入氧化铝坩埚中，并用相同的氧化铝坩埚覆盖，在马弗炉中以3-10℃/min的速率加热至530-570℃，并保持3-6小时后自然冷却至室温；32)将降温后的产物研磨筛分，然后采用稀硝酸浸泡超声2小时，之后以9000-12000rpm离心，得到沉淀物；33)将1份所述沉淀物加入到100mL的5mol/L的HNO3在125℃下回流冷凝24小时，并通过室温自然冷却；34)将冷却后的混合物进行离心并洗涤直至pH达到中性，将洗涤后的产物在真空烘箱中于35-50℃干燥8-12h，得到羧基化g-CN。优选地，PBS为10mmol/L且Ph值为7.4的磷酸盐缓冲溶液。优选地，BSA溶液为质量浓度为0.1％-1％的牛血清白蛋白水溶液。优选地，APTAMER序列为5′-NH2-C6-CGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCG-Fc-3′。优选地，黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1。本专利技术实施例还提供了一种应用上述电致化学发光黄曲霉毒素生物传感器进行黄曲霉毒素检测的方法，包括如下步骤：a.标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的黄曲霉毒素标准溶液；b.工作电极修饰：将所述的电致化学发光黄曲霉毒素生物传感器为工作电极，将步骤a中配制的不同浓度的黄曲霉毒素标准溶液分别滴涂到工作电极表面，于4℃冰箱中保存；c.工作曲线绘制：将银/氯化银电极作为参比电极，铂片电极作为辅助电极，与步骤b所修饰好的工作电极组成三电极系统，连接到电化学荧光检测设备上；在电解槽中先后加入20mLpH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液、0.002mol过硫酸钠、0.002mol氯化钾；待上述溶液充分混合时，采用循环伏安法测试，根据所得的光信号值与黄曲霉毒素标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；d.黄曲霉毒素的检测：用待测样品代替步骤a中的黄曲霉毒素标准溶液，按照步骤b和c中的方法进行检测，根据所得的光信号值和工作曲线，得到待测样品中黄曲霉毒素的含量。由上述本专利技术的电致化学发光黄曲霉毒素生物传感器的制备方法及应用提供的技术方案可以看出，本专利技术方法有益效果如下：1)首先制备了一种二维纳米复合材料石墨相氮化碳，然后利用改材料良好的生物相容性和大的比表面积，负载上特定序列的核酸适配体，然后通过牛血清白蛋白对材料进行非特异性位点封闭，使用该电极材料对玻碳电极进行修饰作为黄曲霉毒素传感器的工作电极，该传感器可应用在实际大米样品的传感测定中；2)进行检测时，核酸适配体端末的二茂铁靠近发光底物石墨相氮化碳，从而进行荧光淬灭，使得光信号强度相应降低；本方法的电极材料合成方法简单、毒性低；应用传统三电极体系作为黄曲霉毒素传感测试体系；该电化学传感器具有非常良好的AFB1电化学传感活性、较高的灵敏度、较宽的线性范围以及较好的检测物选择性；3)本专利技术的电致化学发光黄曲霉毒素生物传感器制备简单，操作方便，实现了对样品的快速、灵敏、高选择性检测，并且成本低，具有一定的市场发展前景；4)本专利技术制备了新型二维纳米复合材料g-CN-APTAMER，将新型电致化学发光底物g-CN与特异性识别单元核酸适配体APTAMER结合，充分发挥了g-CN较高光产率的特点,利用核酸适配体在检测物存在的情况下会进行空间形变对g-CN的光信号输出进行调节，解决了电致化学发光中光信号调节的技术问题，具有一定的科学意义和应用价值；5)本专利技术将g-CN应用于电致化学发光生物传感器的制备中，提高了电致化学发光传感器的检测灵敏度，使得电致化学发光生物传感器实现了在实际工作中的应用，具有广泛的潜在使用价值。本专利技术附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种电致化学发光黄曲霉毒素生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n11)依次使用1.0μm、0.1μm和0.05μm的氧化铝浆料抛光，然后将所述电极分别在乙醇和超纯水中超声处理60s；/n12)将2.5～5μL的g-CN-APTAMER/BSA滴到处理后的电极上，并在氮气中于室温下干燥；/n13)将干燥后的电极用PBS洗涤3次后于4℃冰箱中保存晾干后，即得到电致化学发光黄曲霉毒素生物传感器。/n

【技术特征摘要】
1.一种电致化学发光黄曲霉毒素生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
11)依次使用1.0μm、0.1μm和0.05μm的氧化铝浆料抛光，然后将所述电极分别在乙醇和超纯水中超声处理60s；
12)将2.5～5μL的g-CN-APTAMER/BSA滴到处理后的电极上，并在氮气中于室温下干燥；
13)将干燥后的电极用PBS洗涤3次后于4℃冰箱中保存晾干后，即得到电致化学发光黄曲霉毒素生物传感器。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的g-CN-APTAMER/BSA的制备方法步骤如下：
21)将羧基化g-CN溶于PBS溶液中获取0.01mg/mL的溶液，向1-2份所述溶液中依次加入1-2份浓度为40mmol/L的EDC和1份浓度为10mmol/L的NHS活化，搅拌0.5h-2h，得到混合物；
22)将1份0.4-1μΜ的APTAMER加入所述混合物中，并在4℃下孵育0.5h-1h；23)将1份BSA溶液添加到孵育后的混合物中以封闭非特异性位点，并且在混合后静置1h-2h；
24)将静置后的混合溶液离心并用0.01M的PBS洗涤超声得到均一的g-CN-APTAMER/BSA溶液。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的羧基化g-CN的制备方法为：
31)将10-30份的尿素放入氧化铝坩埚中，并用相同的氧化铝坩埚覆盖，在马弗炉中以3-10℃/min的速率加热至530-570℃，并保持3-6小时后自然冷却至室温；
32)将降温后的产物研磨筛分，然后采用稀硝酸浸泡超声2小时，之后以9000-12000rpm离心，得到沉淀物；
33)将1份所述沉淀物加入到100mL的5mol/L的HNO3在125℃下回流冷凝24小时，并通过室温自然冷却；

【专利技术属性】
技术研发人员：丁克俭，田东岩，
申请(专利权)人：北京交通大学，
类型：发明
国别省市：北京;11