肝星状细胞活化抑制剂的高通量筛选方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种肝星状细胞活化抑制剂的高通量筛选方法，包括以下步骤：步骤1：使用油酸钠、维生素A类和罗格列酮的组合或油酸钠、维生素A类、胰岛素的组合使肝星状细胞回复静息状态；步骤2：分别用胎牛血清、TGF‑β1、PDGFBB/AA、脂多糖或其任意组合共同诱导肝星状细胞再次活化；同时加入待筛选化合物观察某分子对诱导活化条件的抑制作用；步骤3：用染料对肝星状细胞进行染色，酶标仪读取荧光或光吸收量进行定量分析；筛选待测药物，根据活力选出候选活性药物，并证实药效。还公开了一种利用该方法在测定肝星状细胞活化抑制的靶向药物的药效定量分析中的应用。本发明专利技术能够对肝星状细胞的活化状态进行定量检测。

【技术实现步骤摘要】
肝星状细胞活化抑制剂的高通量筛选方法及其应用
本专利技术涉及生物化学领域，特别是涉及一种肝星状细胞活化抑制剂的高通量筛选方法及其应用。
技术介绍
肝星状细胞活化是肝纤维化过程中的关键环节，目前没有针对肝星状细胞激活环节进行抑制的靶向药物。缺少对肝星状细胞活化状态的定量检测方法，也导致了抑制剂药效不容易衡量。1、肝纤维化与肝星状细胞活化肝纤维化是机体的一个创伤修复反应，肝细胞损伤区域被大量的细胞外基质包裹HSC的激活为抗纤维化提供了潜在靶点治疗肝纤维化。肝纤维化形成的过程经历了：1)各种因素造成的肝损伤；2)因子(激活因素)释放；3)肝星状细胞(hepaticstellatecell，HSC)活化、增殖；4)胶原合成、分泌、修饰；5)细胞外胶原纤维积累和清除的过程，其中各个过程所涉及的具体机制都可以作为抗纤维化药物的作用基础。HSC是细胞外基质的主要来源，所以HSC活化是肝纤维化的中心事件。肝脏星状细胞占肝脏固有细胞总数的15％，占非实质细胞的30％左右。HSC存在于Disse腔中，呈梭形或多边形，胞浆内有多个富含维生素A的脂滴(所以也称储脂细胞)，其细长的突起向外延伸环绕在血窦内皮细胞外面，是体内储存视黄醛衍生物的首要部位。在正常肝脏中，星状细胞处于静止状态，不表达α平滑肌肌动蛋白(α-SMA，ATCA2基因编码)，增殖活性低，合成胶原能力低，其主要功能是贮存视黄醛类。在正常肝组织中HSC常处于静息状态。但是当肝脏受到物理、化学和微生物感染等病理因素刺激时HSC就会发生增殖活化转变为其活化形式—肌成纤维样细胞(MFB)，HSC激活后释放脂滴(释放维生素A)是肝内维持稳态的天然防御机制，肝脏细胞及体细胞、脂肪细胞摄取维生素A帮助FXR、PPARs完成生物学功能，例如减少肝细胞内脂质积累、使脂类代谢加快并重新分布于肝以外的器官；之后活化的HSC开始大量合成和分泌胶原表现出明显的细胞增殖、收缩性增加、大量表达α-平滑肌动蛋白(α-SMA)。脂滴容易被油红O染色(ORO染色，是脂滴染色的金标准)，所以从形态特征可以区分出静息与活化状态的HSC。2、用荧光探针标记脂滴脂滴(Lipiddroplets,LDs)由磷脂单分子表层和中性脂内核组成，是细胞内中性脂的主要贮存场所，广泛存在于多种动植物细胞中。近年来的研究发现，脂滴并非是一个“惰性”的能量贮存器，而是活跃的多功能细胞器，它的异常与肥胖、II型糖尿病、脂肪性肝病、高脂血症和动脉粥样硬化等疾病有着密切的联系。因此，脂滴的检测对生物医学研究和临床诊断具有重要意义。近年来，荧光检测方法以其高灵敏性、高分辨率、操作简单和价格低廉等特点逐渐成为生物医学研究的重要研究手段。商业化的脂滴荧光染料主要有尼罗红(NileRed)和BODIPY系列化合物。尼罗红因为双发射波长不适用于基于荧光的筛选。但应用BODIPY时存在的问题是斯托克位移小，光稳定性不好。从2001年聚集诱导发光(aggregation-inducedemission，AIE)的提出至今，AIE被用于解决传统荧光分子面临的问题，AIE脂滴荧光探针便是其中的一个方面。相比传统的商用荧光染料，AIE脂滴荧光探针在成像中具有亮度高、斯托克斯位移大和光稳定性好等优点，能满足研究中细胞内脂滴的跟踪与分析的要求。3、新探针与HSC活化抑制剂筛选HSC活化时脂滴数目或体积减小直至消失，基于此原理形成HSC活化抑制剂筛选方法，选择哪种探针指示脂滴的变化成为关键。一个案例中ORO染色被用来标志HSC活化被抑制剂抑制，但基于光学显微镜观察、照相、图像分析和量化，过程繁琐，不易形成高通量筛选方法。另一个案例中用BODIPY493/503(LifeTechnologies)andHoechst33342(ThermoScientific)染growthfactorreducedMatrigel(BD)中培养的人原代HSC，并用ImageXpressMicro(IXM)系统成像并分析了NIHClinicalCollection1-2013和Biomol4与Microsource1文库的1600个化合物，筛选出21个有效的化合物。这是目前唯一的利用BODIPY染色做筛选的报道，但量化过程仍然基于图像分析。目前尚没有利用酶标仪进行荧光定量来进行高通量筛选HSC活化抑制剂的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种肝星状细胞活化抑制剂的高通量筛选方法及其应用，能够对肝星状细胞的活化状态进行定量检测。为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是：提供一种肝星状细胞活化抑制剂的高通量筛选方法，包括以下步骤：步骤1：使用油酸钠、维生素A类和罗格列酮的组合或油酸钠、维生素A类、胰岛素的组合使肝星状细胞回复静息状态；步骤2：分别用胎牛血清、TGF-β1、PDGFBB/AA、脂多糖或其任意组合共同诱导肝星状细胞再次活化；同时加入待筛选化合物观察某分子对诱导活化条件的抑制作用；步骤3：用染料对肝星状细胞进行染色，酶标仪读取荧光或光吸收量进行定量分析；筛选待测药物，根据活力选出候选活性药物，用免疫印记或RT-PCR方法证实药效。在本专利技术一个较佳实施例中，在步骤1中，所述维生素A类可替换为全反式维甲酸或RXR激动剂。在本专利技术一个较佳实施例中，在步骤3中，根据活力选出候选活性药物的方法是以化合物筛选浓度为0.2nM—200μM在化合物库中筛选出能显著抑制胎牛血清、TGF-β1、PDGFBB/AA、脂多糖或其任意组合诱导的胶原表达的化合物。在本专利技术一个较佳实施例中，该方法具体包括以下步骤：(1)铺板：96孔板中人肝星状细胞LX-2铺2000—5000个细胞/well，10％FBS高糖DMEM100μl培养，人肝星状细胞LX-2经胰酶消化，2000rpm5min离心去上清，12ml培养基吹打、重悬，排枪每孔分100μl，每次吸取细胞后混匀；(2)细胞贴壁后将培养基换成含有2％FBS的DMEM培养12—24h；(3)回复静息：吸出培养基，PBS洗一次(2min之内换培养基)，每孔加入含有50—500nMInsulin、0.1—10μMVitaminA、0.5—2％FBS、1％双抗和50—400μM油酸钠-BSA的DMEM培养12—36h；(4)激活-筛选：培养基含15—50μM油酸钠-BSA、0.1—1μMVitaminA,激活因子为cFBS或0.5—20ng/mlTGF-β或5—50ng/mlLPS或5—50ng/mlPDGFAA/BB或其组合，同时加入终浓度1—50μM的待筛选化合物，24或48h后吸出60μl培养基，缓慢加入150μl中性福尔马林(用PBS配制的4—6％多聚甲醛)，4℃固定过夜；(5)染色后检测：完全弃去固定液，空气中干燥，100μlPBS洗一次10min，采用比色定量或荧光定量分析，比色定量法得到的OD620nm/OD492nm或荧光定量法得到的Bodipy/Hoechst33342荧光强度代本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肝星状细胞活化抑制剂的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1：使用油酸钠、维生素A类和罗格列酮的组合或油酸钠、维生素A类、胰岛素的组合使肝星状细胞回复静息状态；/n步骤2：分别用胎牛血清、TGF-β1、PDGFBB/AA、脂多糖或其任意组合共同诱导肝星状细胞再次活化；同时加入待筛选化合物观察某分子对诱导活化条件的抑制作用；/n步骤3：用染料对肝星状细胞进行染色，酶标仪读取荧光或光吸收量进行定量分析；筛选待测药物，根据活力选出候选活性药物，用免疫印记或RT-PCR方法证实药效。/n

【技术特征摘要】
1.一种肝星状细胞活化抑制剂的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：使用油酸钠、维生素A类和罗格列酮的组合或油酸钠、维生素A类、胰岛素的组合使肝星状细胞回复静息状态；
步骤2：分别用胎牛血清、TGF-β1、PDGFBB/AA、脂多糖或其任意组合共同诱导肝星状细胞再次活化；同时加入待筛选化合物观察某分子对诱导活化条件的抑制作用；
步骤3：用染料对肝星状细胞进行染色，酶标仪读取荧光或光吸收量进行定量分析；筛选待测药物，根据活力选出候选活性药物，用免疫印记或RT-PCR方法证实药效。


2.根据权利要求1所述的肝星状细胞活化抑制剂的高通量筛选方法，其特征在于，在步骤1中，所述维生素A类替换为全反式维甲酸或RXR激动剂。


3.根据权利要求1所述的肝星状细胞活化抑制剂的高通量筛选方法，其特征在于，在步骤3中，根据活力选出候选活性药物的方法是以化合物筛选浓度为0.2nM—200μM在化合物库中筛选出能显著抑制胎牛血清、TGF-β1、PDGFBB/AA、脂多糖或其任意组合诱导的胶原表达的化合物。


4.根据权利要求1至3任一项所述的肝星状细胞活化抑制剂的高通量筛选方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)铺板：96孔板中人肝星状细胞LX-2铺2000—5000个细胞/well，10％FBS高糖DMEM100μl培养，人肝星状细胞LX-2经胰酶消化，2000rpm5min离心去上清，12ml培养基吹打、重悬，排枪每孔分100μl，每次吸取细胞后混匀；
(2)细胞贴壁后将培养基换成含有2％FBS的DMEM培养12—24h；
(3)回复静息：吸出培养基，PBS洗一次(2min之内换培养基)，每孔加入含有50—500nMInsulin、0.1—10μMVitaminA、0.5—2％FBS、1％双抗和50—400μM油酸钠-BSA的DMEM培养12—36h；
(4)激活-筛选：培养基含15—50μM油酸钠-BSA、0.1—1μMVitaminA,激活因子为cFBS或0.5—20ng/mlTGF-β或5—50ng/mlLPS或5—50...

【专利技术属性】
技术研发人员：王阳，柏旭，
申请(专利权)人：厦门市博瑞来医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35