一种测量活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白浓度比的方法，该方法是利用三通道荧光共振能量转移显微镜测量活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白浓度比的方法，包括下列步骤：①测量三通道荧光共振能量转移显微镜漏过系数；②利用三通道荧光共振能量转移显微镜测量活细胞内ＣＦＰ蛋白与ＹＦＰ蛋白浓度之比。本发明专利技术方法的测量结果表明：校正了ＣＦＰ和ＹＦＰ荧光的串扰，校正了由于ＦＲＥＴ的发生而引起的ＣＦＰ荧光的减少和ＹＦＰ荧光的增加，测量的结果稳定，标准误差比较小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白，特别是一种利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，以下简称为FRET)。
技术介绍
FRET是一种无辐射的能量转移过程，是处于激发态的荧光团(供体)通过长程的偶极子—偶极子的相互作用把能量转移给另一个分子(受体)，导致供体荧光的淬灭和受体发光的增强的过程。参见G.W.Gordon，G.Berry，X.H.Liang，B.Levine，B.Herman，Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements usingfluorescence microscopy.Biophys.J.74(1998)2702-2713。为了便于FRET的发生，实验中需要合理的控制供体与受体的浓度之比，然而在活细胞内测量供体与受体的浓度之比是比较困难的事情，目前青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein，简称为CFP蛋白)和黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein，简称为YFP蛋白)是最常用的FRET供体-受体对，测量活细胞内CFP与YFP浓度之比是迫切需要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种，本专利技术的技术解决方案如下一种，更确切地说是利用三通道荧光共振能量转移显微镜测量活细胞内青色荧光蛋白(cyan fluorescentprotein，简称为CFP)和黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein，简称为YFP)浓度之比的方法。推导三通道荧光共振能量转移显微镜测量活细胞内CFP与YFP浓度比的公式表观荧光共振能量转移效率Eapp可以表述如下式参见M.G.Erickson，B.A.Alseikhan，B.Z.Peterson，D.T.Yue，Preassociation of calmodulin with voltage-gatedca2+channels revealed by FRET in single living cells.Neuron 31(2001)973-985Eapp＝E×Db＝[1-SCFP(DA)before/SCFP(DA)after](1)这里，E指FRET效率，Db指发生FRET的CFP分子数与总的CFP分子数的比例，SCFP(DA)before和SCFP(DA)after指YFP荧光蛋白被漂白前后，CFP荧光蛋白的平均荧光强度。同时，表观的FRET效率Eapp又可以表述如下参见T.Zal，N.R.Gascoigne，Photobleaching-Corrected FRET Efficiency Imaging of Live Cells.Biophys.J.86(2004)3923-3939，Eapp=FCFC+G×CFP---(2)]]>这里，CFP指CFP通道的平均荧光强度，FC为净FRET值，其表达式如下参见G.W.Gordon，G.Berry，X.H.Liang，B.Levine，B.Herman，Quantitative fluorescenceresonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy.Biophys.J.74(1998)2702-2713，FC＝FRET-a×YFP-b×CFP(3)这里，FRET指FRET通道的平均荧光强度，YFP指YFP通道的平均荧光强度，CFP指CFP通道的平均荧光强度。a和b分别为YFP和CFP荧光漏到FRET通道内的比例系数，表述如下参见G.W.Gordon，G.Berry，X.H.Liang，B.Levine，B.Herman，Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescencemicroscopy.Biophys.J.74(1998)2702-2713，a＝IFRET(Y)/IYFP(Y)(4)b＝IFRET(C)/ICFP(Y)(5)这里IFRET(Y)表示YFP蛋白在FRET通道内的平均荧光强度，IYFP(Y)表示YFP蛋白在YFP通道内的平均荧光强度，IFRET(C)表示CFP蛋白在FRET通道内的平均荧光强度，ICFP(C)表示CFP蛋白在CFP通道内的平均荧光强度。有效的FRET效率EEFF可以表述如下参见M.G.Erickson，B.A.Alseikhan，B.Z.Peterson，D.T.Yue，Preassociation of calmodulin with voltage-gated ca2+channelsrevealed by FRET in single living cells.Neuron 31(2001)973-985，EEFF=E×Ab=(FR-1)×ϵYFP(440)ϵCFP(440)---(6)]]>FR=FRET-b×CFPa×YFP---(7)]]>这里，E指FRET效率，Ab指发生FRET的受体与总的受体的比例，εYFP(440)/εCFP(440)指在440nm波长光激发时YFP与CFP的吸收系数之比，其值为0.09参见M.G.Erickson，B.A.Alseikhan，B.Z.Peterson，D.T Yue，Preassociation of calmodulinwith voltage-gated ca2+channels revealed by FRET in single living cells.Neuron31(2001)973-985。将式(6)与式(1)相除可以得到，EEFFEapp=E×AbE×Db=[DA]/[A][DA]/[D]=[D][A]---(8)]]> 这里，[DA]，[A]和[D]分别表示供体-受体复合体、受体和供体的浓度。同时，将式(6)和式(2)相除又可以得到，EEFFEapp=(FR-1)×ϵYFP(440)ϵCFP(440)FCFC+G×CFP---(9)]]>把式(7)的FR带入式(9)，可以得到EEFFEapp=(FC+G×CFP)a×YFP×ϵYFP(440)ϵCFP(440)---(10)]]>由于式(8)和式(10)相等，我们就可以得到CFP与YFP浓度之比，[D][A]=(FC+G×CFP)a×YFP×ϵYFP(440)ϵCFP(440)---(11)]]>这里，G的值为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测量活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白浓度比的方法，特征在于该方法是利用三通道荧光共振能量转移显微镜测量活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白浓度比的方法，青色荧光蛋白以下简称为ＣＦＰ蛋白，黄色荧光蛋白以下简称为ＹＦＰ蛋白，包括下列步骤： ①测量三通道荧光共振能量转移显微镜漏过系数：在中国仓鼠卵巢癌细胞，简称为ＣＨＯ细胞，内分别表达ＣＦＰ蛋白和ＹＦＰ蛋白，分别测量表达ＹＦＰ蛋白的ＣＨＯ细胞在荧光共振能量转移通道，简称为ＦＲＥＴ通道和ＹＦＰ通道内的平均荧光强度，利 用下列公式计算漏过系数ａ，ａ＝Ｉ↓［ＦＲＥＴ（Ｙ）］／Ｉ↓［ＹＦＰ（Ｙ）］分别测量表达ＣＦＰ蛋白的ＣＨＯ细胞在ＦＲＥＴ通道和ＣＦＰ通道内的平均荧光强度，根据下式计算漏过系数ｂ，ｂ＝Ｉ↓［ＦＲＥＴ（Ｃ）］／Ｉ↓［ＣＦＰ （Ｙ）］式中：Ｉ↓［ＦＲＥＴ（Ｙ）］表示ＹＦＰ蛋白在ＦＲＥＴ通道内的平均荧光强度，Ｉ↓［ＹＦＰ（Ｙ）］表示ＹＦＰ蛋白在ＹＦＰ通道内的平均荧光强度，Ｉ↓［ＦＲＥＴ（Ｃ）］表示ＣＦＰ蛋白在ＦＲＥＴ通道内的平均荧光强度，Ｉ↓［ＣＦＰ（Ｃ） ］表示ＣＦＰ蛋白在ＣＦＰ通道内的平均荧光强度；②利用三通道荧光共振能量转移显微镜测量活细胞内ＣＦＰ蛋白与ＹＦＰ蛋白浓度之比：在ＣＨＯ细胞内共表达ＣＦＰ和ＹＦＰ，共表达ＣＦＰ和ＹＦＰ的ＣＨＯ细胞用三通道荧光共振能量转移显微镜分 别记录ＣＦＰ通道、ＹＦＰ通道和ＦＲＥＴ通道内的平均荧光强度，根据下式，计算三ＣＨＯ细胞内的ＣＦＰ蛋白和ＹＦＰ蛋白浓度之比：［Ｄ］／［Ａ］＝（Ｆ↓［Ｃ］＋Ｇ×ＣＦＰ）／ａ×ＹＦＰ×ε↓［ＹＦＰ］（４４０）／ε↓［ＣＦＰ］（４４０） 式中：Ｆ↓［Ｃ］为净ＦＲＥＴ值，Ｆ↓［Ｃ］＝ＦＲＥＴ－ａ×ＹＦＰ－ｂ×ＣＦＰＧ称为Ｇ参数，ε↓［ＹＦＰ］（４４０）／ε↓［ＣＦＰ］（４４０）指在４４０ｎｍ波长的光激发时，ＹＦＰ蛋白与ＣＦＰ蛋白的吸收系数之比，其值为０．０ ９４，ＣＦＰ和ＹＦＰ分别表示ＣＦＰ通道和ＹＦＰ通道内的平均荧光强度，ＦＲＥＴ为ＦＲＥＴ通道的平均荧光强度。...
【技术特征摘要】
1.一种测量活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白浓度比的方法，特征在于该方法是利用三通道荧光共振能量转移显微镜测量活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白浓度比的方法，青色荧光蛋白以下简称为CFP蛋白，黄色荧光蛋白以下简称为YFP蛋白，包括下列步骤①测量三通道荧光共振能量转移显微镜漏过系数在中国仓鼠卵巢癌细胞，简称为CHO细胞，内分别表达CFP蛋白和YFP蛋白，分别测量表达YFP蛋白的CHO细胞在荧光共振能量转移通道，简称为FRET通道和YFP通道内的平均荧光强度，利用下列公式计算漏过系数a，a＝IFRET(Y)/IYFP(Y)分别测量表达CFP蛋白的CHO细胞在FRET通道和CFP通道内的平均荧光强度，根据下式计算漏过系数b，b＝IFRET(C)/ICFP(Y)式中IFRET(Y)表示YFP蛋白在FRET通道内的平均荧光强度，IYFP(Y)表示YFP蛋白在YFP通道内的平均荧光强度，IFRET(C)表示CFP蛋白在FRET通道内的平均荧光强度，ICFP(C)表示CFP蛋白在CFP通道内的平均荧光强度；②利用三通道荧光共振能量转移显微镜测量活细胞内CFP蛋白与YFP蛋白浓度之比在CHO细胞内共表达CFP和YFP，共表达CFP和...
【专利技术属性】
技术研发人员：付国，王桂英，徐至展，
申请(专利权)人：中国科学院上海光学精密机械研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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