一株肠炎沙门氏菌噬菌体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一株肠炎沙门氏菌噬菌体及其应用，属于生物技术领域；一种强裂解性噬菌体，其特征在于：该噬菌体保藏号为GDMCC N0：61171‑B1，在2020年8月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，分类学名称为肠炎沙门氏菌噬菌体亚种，即Salmonella enterica subsp.enterica bacteriophage，对肠炎沙门氏菌具有高效杀菌能力。

【技术实现步骤摘要】
一株肠炎沙门氏菌噬菌体及其应用
本专利技术具体涉及生物
，具体涉及一株肠炎沙门氏菌的强裂解性噬菌体PSM6防治沙门氏菌污染方面的应用。
技术介绍
沙门氏菌(Salmonella)居食源性致病菌之首，常引起严重的食品安全事故和人畜患性疾病，是全球重点关注公共卫生问题之一。其中，肠炎沙门氏菌是最常见的沙门氏菌的污染可发生在食物链的任何一个环节，包括收获、生产、加工、保存等多个从农场到消费者的阶段。例如，沙门氏菌可隐藏在灌溉水中进而污染果蔬和农作物，也能以生物膜的形式覆盖在食品生产加工过程中的机器设备和保存用具的表面。目前，控制沙门氏菌污染的主要手段是使用抗生素。然而，细菌在抗生素的选择压力下会通过突变产生多重耐药性，甚至这种多重耐药性可以在肠道病原体迅速转移增加。在这场抗生素耐药(antimicrobialresistance，AMR)的全球性健康危机中，如果还不采取有效措施，到2050年，每年因细菌耐药造成死亡病例将可能攀升至1000万/年，与目前每年死于癌症的人数相当。噬菌体，在自然界中广泛存在的细菌“天敌”，不受抗生素耐药性的制约被视为对付多重耐药菌新的希望，因此也成为了当前的研究热点。现阶段已有多株沙门氏菌噬菌体在畜禽养殖和食品工业等方面去除病原菌取得了较好的成果，但是满足于不同生产加工条件的噬菌体的种类数量是限制噬菌体治疗进一步发展应用的重要原因。因此，分离和鉴定噬菌体并展开相关研究来丰富噬菌体种库尤为重要。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一株沙门氏菌噬菌体PSM6及其应用。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一株沙门氏菌噬菌体PSM6，保藏编号为GDMCCN0：61171-B1，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址广东省广州市先烈中路100号大院59号5楼广东省微生物研究所，保藏日期为2020年8月25日，分类命名为Salmonellaentericasubsp.entericabacteriophage，属于肌尾噬菌体。进一步，肠炎沙门氏菌噬菌体PSM6在裂解沙门氏菌中的应用。进一步，肠炎沙门氏菌噬菌体PSM6去除沙门氏菌生物膜中的应用。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一株沙门氏菌噬菌体PSM6及其应用，为病原菌的防控提供一种候选基础材料，丰富噬菌体种库，扩宽相关噬菌体鸡尾酒的裂解范围和应用范围；噬菌体PSM6可快速高效裂解沙门氏菌，可用于生物膜条件下沙门氏菌的污染的去除及防治其耐药宿主菌。附图说明图1为本专利技术噬菌体PSM6的噬菌斑形态；图2为本专利技术噬菌体PSM6的透射电镜形态；图3为本专利技术噬菌体PSM6的温度稳定性测定结果图；图4为本专利技术噬菌体PSM6的pH稳定性测定结果图；图5为本专利技术噬菌体PSM6对生物膜状态下的沙门氏菌的消减效果图；具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本保护的范围。实施例1、噬菌体的分离纯化本实验使用经高压蒸汽灭菌后的塑料瓶，采集的东莞东江河水为样品，以8000r/min离心水样15min，用0.22um过滤注射器过滤上清。提前将冻存的肠炎沙门氏菌(GIM1.1105)菌液三区划线，接种于显色培养基，置于37℃培养箱约12h，取单菌落接种到LB液体培养基中，37℃、180r/min振荡培养至对数期，得到新鲜菌液。取5mL过滤上清于20mLLB液体培养基中，再加入500μL菌液和2mLSM缓冲液，混匀后再置于37℃、220r/min摇床培养12小时获得富集液。富集液重复离心过滤取噬菌体上清，按上述步骤再处理2次，形成噬菌体原液。用SM缓冲液对噬菌体原液进行10倍稀释。取100μL不同倍数的稀释液与100μL菌液于灭菌好的96孔细胞培养板中，混匀静置反应15-20分钟后，吸入到45℃保温的10mlLB半固体培养基，混匀后迅速倒入LB固体培养基平板上层，待其凝固，置于37℃温箱培养8小时后观察，获得形成噬菌斑的双层平板。在15小时内，挑取双层平板上1个透亮、圆润的噬菌斑，置于含100μL菌液和8mLSM缓冲液的8mL2倍LB液体培养基的试管中，将其倾斜在37℃、220r/min摇床中培养12小时摇床完毕后，重复上述方法，进行3-5次纯化，直到平板上所出现的噬菌斑的大小形态均匀一致为止，详见图1。实施例2、噬菌体的电镜观察取10μL扩增培养后的噬菌体滤液滴于铜网上，自然沉淀10min，用滤纸从侧面吸干多余的液体后加1滴2％磷钨酸到铜网上，染色10min，待铜网干燥后用透射式电镜观察PSM6的形态。电镜观察结果显示，噬菌体PSM6由正二十面体的头部和可收缩的尾部，属于肌尾噬菌体，电镜照片显示，PSM6头部直径约为69±5nm，尾部长度约为115±6nm，详见图2。实施例3、噬菌体热稳定性的测定取1000μL噬菌体滤液(约108PFU/mL)于1.5mlEP管中，分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的水浴中作用2h，每隔20min取样，并立即将样品置于冰上冷却，经过10倍梯度稀释后测定噬菌体的效价、分析噬菌体的存活情况、并使用GraphPadPrism8处理数据。热稳定性测定结果显示，随着温度的升高，PSM6效价下降的速度越快。在40℃作用2h，噬菌体PSM6维持原有活性，效价基本不变。在60℃作用2h后，效价仍有107.4PFU/mL，存活率约25％；在80℃作用2h，PSM6的效价最低，下降到106.2PFU/mL。总体上分析，PSM6的热稳定性较强，详见图3。实施例4、噬菌体的pH稳定性取100μL噬菌体滤液(约108PFU/mL)于1.5mlEP管中，分别加入900μL不同pH值(即pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的tris-HCl缓冲液，37℃、200r/min摇床培养2小时后，取100μL进行10倍梯度稀释，用双层平板法测定噬菌体效价，重复3次。通过计算效价，得出该噬菌体最适pH值。pH稳定性测定结果显示，PSM6在pH为5-10的范围内效价稳定，活性较高，存活率大于80％；pH＝4时，效价下降明显，存活率约11.3％；在pH＝2、3、11、12、13的极端环境中，噬菌体效价降低到低于检出限(即存活率低于0.1％)，详见图4。实施例5、噬菌体对生物膜条件下沙门氏菌的削减效果将宿主菌过夜培养后调整浓度为1x109CFU/mL,用稀释10倍后的LB培养基稀释100倍，转移至96孔聚苯乙稀细胞培养板，200μL/孔,不加宿主菌(LB培养基)为阴性对照组，在37℃静置培养24h，吸弃重新加入200μLLB培养基培养12h；倾去培养物，PBS轻柔洗涤3次，去除生物膜表面的浮游细菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株噬菌体，其特征在于:该噬菌体PSM6保藏号为GDMCC N0：61171-B1，于2020年8月25日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，分类命名为肠炎沙门氏菌噬菌体，Salmonellaenterica subsp.enterica bacteriophage，为肌尾噬菌体。/n

【技术特征摘要】
1.一株噬菌体，其特征在于:该噬菌体PSM6保藏号为GDMCCN0：61171-B1，于2020年8月25日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，分类命名为肠炎沙门氏菌噬菌体，Salmonellaentericasubsp.entericabacteriophage，为肌尾噬菌体。


2.根据权利要求1所述的一株噬菌体，其特征在于：在40℃水浴处理2h，噬菌体PSM6维持原有活性，效价基本不变。随着温度的升高，PSM6效价下降的速度越快。在80℃作用2h，PSM6的效...

【专利技术属性】
技术研发人员：林伯坤，黄景晓，尚俊康，梁文锐，陈慧敏，沈嘉旻，黎圆圆，喻玉立，倪进东，
申请(专利权)人：广东医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44