一种血塞通注射剂物质基础数据库的建立方法技术

本发明专利技术涉及UPLC‑Orbitrap HRMS技术领域，特别涉及一种血塞通注射剂物质基础数据库的建立方法。该方法为：取供试品和对照品，利用UPLC‑Orbitrap HRMS进行分离和鉴定；供试品中未知化合物根据高分辨质谱数据预测分子组成，并进行化合物推断；利用Database Manager建立数据库。本发明专利技术对血塞通注射剂的物质基础进行系统性研究，为血塞通的进一步开发利用提供基础性研究资料，并对其系统研究皂苷类成分的药效物质基础并明确与功能主治的相关性，对血塞通中有效成分的二次开发具有指导意义。

【技术实现步骤摘要】
一种血塞通注射剂物质基础数据库的建立方法
本专利技术涉及UPLC-OrbitrapHRMS
，特别涉及一种血塞通注射剂物质基础数据库的建立方法。
技术介绍
中药化学成分复杂，如何快速、全面地鉴定中药化学成分、阐明中药药效物质基础以及建立稳定全面的质量控制方法是中药现代研究和国际化面临的重要难题。目前，中药的物质基础与质量控制研究尚不能全面反映中药复杂物质体系的内涵与特征性，缺乏高效、精确鉴定化学物结构的方法是一个重要原因。传统的中药化学成分研究方法为：通过利用反复柱层析等手段从原料中提取、纯化单体物质，再利用UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、MS等方法进行结构鉴定。这不仅需要花费大量的人力、物力和财力，而且中药中含量低的成分也大多损失殆尽，无法获取药材全面的信息特征。血塞通注射液是以三七总皂苷为原料精制而成的中药注射剂。近年来有关血塞通注射剂的不良反应时有报道，其临床安全性引起社会关注。究其原因，血塞通注射剂的化学成分复杂、药效物质不甚明确可能是影响血塞通注射液临床安全性的主要因素。至今为止，关于血塞通注射剂发挥药效作用的化学成分以及作用机制的研究报道较少。因此，对血塞通注射液中的皂苷类药效物质化学结构及其药理作用进行了系统研究，对保证血塞通注射液的质量稳定、用药安全以及血塞通注射液中有效成分的二次开发均具有十分重要的意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种血塞通注射剂物质基础数据库的建立方法。该方法对血塞通注射剂的物质基础进行系统性研究，为血塞通的进一步开发利用提供基础性研究资料，并对其系统研究皂苷类成分的药效物质基础并明确与功能主治的相关性，对血塞通中有效成分的二次开发具有指导意义。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种血塞通注射剂物质基础数据库的建立方法，包括如下步骤：分别取供试品溶液和对照品溶液，利用UPLC-OrbitrapHRMS进行分离和鉴定，UPLC-OrbitrapHRMS的色谱条件和质谱条件如下：色谱条件：BrigeShieldRP18色谱柱；流动相A为0.08vt％～0.12vt％甲酸水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序为：0min，18％B；10min，18％B；28min，26％B；51min，30％B；67min，39％B；85min，64％B；质谱条件：工作模式：ESI-，FullMS/dd-MS2(TopN)模式，扫描范围m/z150～2000，分辨率60000～80000；离子源参数：鞘气流速60～70arb，辅助气流速15～25arb，吹扫气流速3～5arb，喷雾电压2.0～3.0kV，毛细管温度280～320℃，S-lens电压45～55V，加热温度450～550℃；根据CID裂解所产生的中性丢失碎片，判断对照品所连接糖基种类与数量，同时推断端基位糖基类别；供试品中未知化合物根据高分辨质谱数据预测分子组成，并根据其多级质谱碎片信息推断化合物所连接糖基个数与种类，与已知化合物的分子质量、化学结构、保留时间和质谱裂解行为比对，进行化合物推断；所得质谱图、MSn质谱树、色谱图、化学结构和未知化合物特性的自定义库利用DatabaseManager建立数据库。在本专利技术中，对照品为：从血塞通注射剂样品中分离出15种皂苷成分RSZG-1～RSZG-15，并分别鉴定为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、20(S)-人参皂苷Rf、20(S)-人参皂苷Rh1、20(S)-人参皂苷Rg2、人参皂苷Rb1、20(S)-人参皂苷F1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷Rk3、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rg3，作为对照品溶液成分。作为优选，从血塞通注射剂样品中分离出15种皂苷单体RSZG-1～RSZG-15具体为：采用D101大孔树脂对血塞通注射剂样品水溶液进行分离，依次用水、30vt％乙醇水溶液、50vt％乙醇水溶液、70vt％乙醇水溶液、90vt％乙醇水溶液洗脱，得到50vt％乙醇洗脱液、70vt％乙醇洗脱液、90vt％乙醇洗脱液；50vt％乙醇洗脱液经MDS柱色谱，用30vt％～90vt％甲醇水溶液进行梯度洗脱得到三个部位Fr.1、Fr.2、Fr.3；Fr.1经MCI柱色谱，用40vt％～60vt％甲醇水溶液进行梯度洗脱得到两个流分Fr.1.1、Fr.1.2，Fr1.1通过50％乙醇水溶液重结晶得RSZG-12；Fr.1.2经RP-ODS柱色谱，用40vt％～65vt％甲醇水溶液进行梯度洗脱，再经SephadexLH-20柱纯化得RSZG-11、RSZG-13；Fr.2经硅胶柱色谱，用体积比为(100：18：0.5)～(80：20：0.1)氯仿-甲醇-水梯度洗脱得2个流分Fr.2.1、Fr.2.2；Fr.2.1经SephadexLH-20柱纯化得RSZG-10；Fr.2.2经半制备液相色谱纯化得RSZG-4、RSZG-5；Fr.3经RP-ODS反相柱色谱，用40vt％～60vt％甲醇水溶液进行梯度洗脱，再经反复SephadexLH-20柱色谱纯化得RSZG-1、RSZG-9；70vt％乙醇洗脱液经硅胶柱色谱，用体积比为(100：3：0.1)～(7：3：0.5)氯仿-甲醇-水梯度洗脱得Fr.4、Fr.5、Fr.6；Fr.4经反复硅胶色谱、SephadexLH-20柱色谱纯化得到RSZG-3；Fr.5经ODS反相柱色谱，用65vt％～85vt％甲醇水溶液进行梯度洗脱得2个流分Fr.5.1、Fr.5.2；Fr.5.1经SephadexLH-20柱色谱纯化得RSZG-8；Fr.5.2经半制备液相色谱纯化得RSZG-6、RSZG-7；Fr.6经MDS反相柱色谱，用55vt％甲醇水溶液洗脱，再经甲醇重结晶得RSZG-2；90vt％乙醇洗脱液经硅胶柱色谱，用体积比为100：(1～50)：50石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，石油醚的温度为60～90℃，再经反复SephadexLH-20柱色谱纯化得RSZG-14、RSZG-15。作为优选，Fr.2.2经半制备液相色谱纯化得RSZG-4、RSZG-5具体为：Fr.2.2经半制备液相色谱，流速1.5mL·min-1，波长203mm，65％甲醇水溶液纯化得RSZG-4、RSZG-5。作为优选，Fr.5.2经半制备液相色谱纯化得RSZG-6、RSZG-7具体为：Fr.5.2经半制备液相色谱，流速1.5mL·min-1，波长203mm，65％甲醇水溶液纯化得RSZG-6、RSZG-7。作为优选，对照品溶液为皂苷成分的甲醇溶液；供试品溶液的制备方法为：取血塞通注射剂样品，用65vt％～75vt％甲醇水溶液溶解，微孔滤膜过滤，取续滤液超声4～6分钟；以mg/mL计，血塞通注射剂样品与甲醇水溶液的比例为(3～7)：10。优选地，对照品溶液为皂苷成分的甲醇溶液；供试品溶液的制备方法为：取血塞通注射剂样品，用70vt％甲醇水本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血塞通注射剂物质基础数据库的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：/n分别取供试品溶液和对照品溶液，利用UPLC-Orbitrap HRMS进行分离和鉴定，所述UPLC-Orbitrap HRMS的色谱条件和质谱条件如下：/n色谱条件：Brige Shield RP18色谱柱；流动相A为0.08vt％～0.12vt％甲酸水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序为：0min，18％B；10min，18％B；28min，26％B；51min，30％B；67min，39％B；85min，64％B；/n质谱条件：/n工作模式：ESI

【技术特征摘要】
1.一种血塞通注射剂物质基础数据库的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
分别取供试品溶液和对照品溶液，利用UPLC-OrbitrapHRMS进行分离和鉴定，所述UPLC-OrbitrapHRMS的色谱条件和质谱条件如下：
色谱条件：BrigeShieldRP18色谱柱；流动相A为0.08vt％～0.12vt％甲酸水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序为：0min，18％B；10min，18％B；28min，26％B；51min，30％B；67min，39％B；85min，64％B；
质谱条件：
工作模式：ESI-，FullMS/dd-MS2(TopN)模式，扫描范围m/z150～2000，分辨率60000～80000；
离子源参数：鞘气流速60～70arb，辅助气流速15～25arb，吹扫气流速3～5arb，喷雾电压2.0～3.0kV，毛细管温度280～320℃，S-lens电压45～55V，加热温度450～550℃；
根据CID裂解所产生的中性丢失碎片，判断对照品所连接糖基种类与数量，同时推断端基位糖基类别；
供试品中未知化合物根据高分辨质谱数据预测分子组成，并根据其多级质谱碎片信息推断化合物所连接糖基个数与种类，与已知化合物的分子质量、化学结构、保留时间和质谱裂解行为比对，进行化合物推断；
所得质谱图、MSn质谱树、色谱图、化学结构和未知化合物特性的自定义库利用DatabaseManager建立数据库。


2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述对照品为：从血塞通注射剂样品中分离出15种皂苷成分RSZG-1～RSZG-15，并分别鉴定为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、20(S)-人参皂苷Rf、20(S)-人参皂苷Rh1、20(S)-人参皂苷Rg2、人参皂苷Rb1、20(S)-人参皂苷F1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷Rk3、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rg3，作为对照品溶液成分。


3.根据权利要求2所述的建立方法，其特征在于，所述从血塞通注射剂样品中分离出15种皂苷单体RSZG-1～RSZG-15具体为：
采用D101大孔树脂对血塞通注射剂样品水溶液进行分离，依次用水、30vt％乙醇水溶液、50vt％乙醇水溶液、70vt％乙醇水溶液、90vt％乙醇水溶液洗脱，得到50vt％乙醇洗脱液、70vt％乙醇洗脱液、90vt％乙醇洗脱液；
所述50vt％乙醇洗脱液经MDS柱色谱，用30vt％～90vt％甲醇水溶液进行梯度洗脱得到三个部位Fr.1、Fr.2、Fr.3；
所述Fr.1经MCI柱色谱，用40vt％～60vt％甲醇水溶液进行梯度洗脱得到两个流分Fr.1.1、Fr.1.2，所述Fr1.1通过50％乙醇水溶液重结晶得RSZG-12；所述Fr.1.2经RP-ODS柱色谱，用40vt％～65vt％甲醇水溶液进行梯度洗脱，再经SephadexLH-20柱纯化得RSZG-11、RSZG-13；
所述Fr.2经硅胶柱色谱，用体积比为(100：18：0.5)～(80：20：0.1)氯仿-甲醇-水梯度洗脱得2个流分Fr.2.1、Fr.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱常成，刘暘，杨兆祥，李修齐，李宁，
申请(专利权)人：昆药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53