一种基于自动视觉检测的单细胞孔板测序中鉴定细胞个数的新方法及系统技术方案

本发明专利技术提供了一种基于自动视觉检测的单细胞孔板测序中鉴定细胞个数的新方法及系统。该方法包括：首先读入孔板中的细胞显微拍照彩色图像，并将所述彩色图像转换为灰度图像；然后使用形态学滤波之Tophat滤波和Bottomhat滤波对图像进行增强；接着利用高斯滤波对增强后的细胞图像进行去噪处理；再使用Otsu算法，对处理后的图像进行分割，得到细胞目标；利用细胞目标的最小外接矩形计算目标的形状因子，根据形状因子进行合格细胞的鉴定；最后对图像中的合格细胞进行统计，当合格细胞数为1时，判定为合格的单细胞图像。本发明专利技术能够快速准确地判断单细胞孔板测序中某孔板下是否为单细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种基于自动视觉检测的单细胞孔板测序中鉴定细胞个数的新方法及系统
本专利技术涉及单细胞孔板测序中的细胞个数鉴定方法，具体涉及一种新型的单细胞孔板测序中鉴定细胞个数的图像处理方法及系统。
技术介绍
细胞是生物体的基本单位。不同细胞类型之间形态和功能不同。同一类型的细胞虽然在定义上是同质的,但是事实上是存在异质性的。所谓的同一类型只是一种对细胞研究的极度简化。对细胞异质性的研究,应当是在单细胞层面上对其DNA、RNA和蛋白质等进行解析。单细胞测序技术就是在单个细胞层面进行分析。它能够针对起始样本量进行扩增,获得足够的样品量用于构建文库,并且通过增加测序深度来检测中低丰度的基因表达,精准地分析细胞异质性,这是传统的细胞群体技术无法达到的。近十年以来,单细胞测序技术得到迅速发展,使我们能够在单个细胞水平上探讨基因表达的差异,发现细胞的异质性,从而改写传统生物学观点,并利用这类技术进行治疗疾病、修复组织、辅助生殖和筛选药物等。单细胞测序技术中的核心步骤——单个细胞分离，主要分为两个类型：基于微滴技术进行“油包水”的单细胞形成方式和基于微孔捕获技术的单细胞形成方式。基于微滴技术进行“油包水”的单细胞形成方式是将单个细胞包裹在μl级别的液滴中，液滴被搭载到建库所用的酶上，每个微滴包含一个唯一的条码，由那个被包装好的细胞产生的所有reads都贴上该条码。基于微孔捕获技术的单细胞形成方式可以使用细胞移液器或激光捕获分离细胞，并将他们放置于微液流孔中。这种方法的优势是：1、可以与荧光触发细胞分离技术(FACS)结合，实现基于表面标记的细胞选择。2、可以对细胞进行拍照，帮助确定孔中是否存在损伤的或者重复的细胞。缺点是：通量低，对每个细胞进行操作需要很大的工作量且无法保证每个孔中一定只有一个细胞，如果有两个或者两个以上，容易出现检测错误。目前世界上还未见报道有方法能够快速便捷且准确地确定每个微孔中的细胞个数，唯一报道的方法是利用人工观察的方法，借助显微镜，一个孔一个孔地观察。这种方法费时费力且容易出错。自动视觉检测技术(AutomatedVisualInspection，简称AVI)为快速准确地确定每个微孔中的细胞个数提供了新的解决方案。AVI是机器视觉系统的核心技术，该技术首先通过图像采集系统获得待测目标物的数字图像，然后利用图像增强方法突出目标物，再利用图像分割方法将目标与背景分离，接着对目标进行特征提取，最后利用提取的特征实现决策。利用AVI技术进行单细胞孔板中的细胞个数鉴定，关键是针对捕获的显微拍照结果进行背景均一化和对杂质的区分。均一化程度以及对杂质的区分准确度将直接影响到后续的细胞计数结果。考虑到现在微孔捕捉技术中，除了人工进行每个孔的显微观察之外，没有一种自动化的方法能够快速而准确地区分每个孔板中到底是一个细胞还是一个以上的细胞，所以希望设计出一种新方法可以准确的确定这个结果。目前未见相关模型或方法的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种基于AVI的单细胞孔板测序中鉴定细胞个数的新方法，以实现对单细胞测序中微孔捕捉技术的优化。本专利技术的目的之二是提供一种基于AVI的单细胞孔板测序中鉴定细胞个数的系统，该系统可以快速准确地鉴定微孔细胞图像是否为单细胞图像。本专利技术的目的之一是这样实现的：一种基于AVI的单细胞孔板测序中鉴定细胞个数的新方法，包括如下步骤：S1：读入孔板中的细胞显微拍照彩色图像，并将所述彩色图像转换为灰度图像；S2：由于显微镜的光源为点光源，导致显微拍照中的图像亮度不均匀，难以实现后续的图像精确分割。为了解决图像亮度不均匀问题，使用形态学滤波之Tophat滤波进行处理，得到亮度均匀的图像背景。S3：由于进行显微拍照的细胞为透明未染色的，对象不易快速抓取。为了解决细胞图像不突出的问题，使用形态学滤波之Bottomhat滤波进行处理，得到被增强的图像前景。S4：将得到的前景与背景融合，得到增强的细胞图像。S5：由于孔板细胞显微拍照得到的图像中可能包含一些噪声，为了避免噪声对后续图像处理的影响，利用高斯滤波对增强后的细胞图像进行去噪处理。S6：使用Otsu算法，对处理后的图像进行分割，得到细胞目标。S7：由于孔板显微拍照图像中可能包含一些杂质或者已经死亡的细胞，所以利用每个细胞目标的最小外接矩形计算每个目标的形状因子，进行合格细胞的鉴定。当形状因子小于指定阈值时鉴定为合格细胞。S8：由于最终希望确定的是每个孔板中是否只有一个细胞，所以对图像中的合格细胞进行统计，当合格细胞数为1时，判定为合格的单细胞图像。其中，所述步骤S2中，形态学滤波之Tophat滤波变换实际上是原图像与其“开运算”的结果图之差。Tophat滤波算法的数学表达式如下：顶帽滤波用于校正不均匀光照的影响，可以获得亮度均匀的背景。所述步骤S3中，形态学滤波之Bottomhat滤波变换实际上是图像“闭运算”的结果图与原图之差。Bottomhat滤波算法的数学表达式如下：g(x,y)＝close(I(x,y))-I(x,y),当close(I(x,y))>＝I(x,y)时否则g(x,y)＝0底帽滤波用于分离比临近点暗一些的部分，主要用于获得目标的轮廓本专利技术的目的之二是这样实现的：一种基于AVI单细胞孔板测序中鉴定细胞数量的图像处理系统，包括：图像转换模块，用于读入细胞的显微拍照彩色图像，并将所述细胞的显微拍照彩色图像转换为细胞的灰度图像。图像增强模块，用于根据灰度结果，使用形态学滤波之Tophat滤波变换和形态学滤波之Bottomhat滤波变换对细胞灰度图像进行图像增强，并利用高斯滤波去除热噪声，以提高细胞灰度图像的质量。图像分割模块，用于将增强后的细胞灰度图像进行二值化分割，以使得细胞灰度图像中的细胞目标图像从背景中分离出来。图像鉴定模块，用于实现健康细胞的识别及其个数统计，根据统计结果判断当前图像是否为合格的单细胞图像。附图说明图1为本专利技术基于AVI的单细胞孔板测序中鉴定单细胞图像的算法处理流程示意图。图2为本专利技术基于AVI的单细胞孔板测序中鉴定单细胞图像的软件系统结构示意图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。如图1所示，本专利技术所提供的一种新型的基于自动视觉检测的单细胞孔板测序中鉴定细胞数量的图像处理方法。模拟微孔捕获技术的单细胞形成方式，将悬浮细胞培养到对数生长期之后，800r/min离心5分钟。重悬，稀释后计数。最终得到每100μL中有一个细胞的密度(即10ml中有100个细胞)。将其均匀的种到96孔板中，模拟每个孔中一个细胞的状态。静置十分钟后，使用倒置显微镜(10×目镜和5×物镜)进行显微拍照，获得原始图像。针对得到的图像，需要进行灰度转化，将细胞显微拍本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于自动视觉检测的单细胞孔板测序中鉴定细胞个数的新方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/nS1：读入孔板中的细胞显微拍照彩色图像，并将所述彩色图像转换为灰度图像；/nS2：由于显微镜的光源为点光源，导致显微拍照中的图像亮度不均匀，难以实现后续的图像精确分割，为了解决图像亮度不均匀问题，使用形态学滤波之Tophat滤波进行处理，得到亮度均匀的图像背景。/nS3：由于进行显微拍照的细胞为透明未染色的，对象不易快速抓取，为了解决细胞图像不突出的问题，使用形态学滤波之Bottomhat滤波进行处理，得到被增强的图像前景。/nS4：将得到的前景与背景融合，得到增强的细胞图像。/nS5：由于孔板细胞显微拍照得到的图像中可能包含一些噪声，为了避免噪声对后续图像处理的影响，利用高斯滤波对增强后的细胞图像进行去噪处理。/nS6：使用Otsu算法，对处理后的图像进行分割，得到细胞目标。/nS7：由于孔板显微拍照图像中可能包含一些杂质或者已经死亡的细胞，所以利用每个细胞目标的最小外接矩形计算每个目标的形状因子，进行合格细胞的鉴定，当形状因子小于指定阈值时鉴定为合格细胞。/nS8：由于最终希望确定的是每个孔板中是否只有一个细胞，所以对图像中的合格细胞进行统计，当合格细胞数为1时，判定为合格的单细胞图像。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于自动视觉检测的单细胞孔板测序中鉴定细胞个数的新方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1：读入孔板中的细胞显微拍照彩色图像，并将所述彩色图像转换为灰度图像；
S2：由于显微镜的光源为点光源，导致显微拍照中的图像亮度不均匀，难以实现后续的图像精确分割，为了解决图像亮度不均匀问题，使用形态学滤波之Tophat滤波进行处理，得到亮度均匀的图像背景。
S3：由于进行显微拍照的细胞为透明未染色的，对象不易快速抓取，为了解决细胞图像不突出的问题，使用形态学滤波之Bottomhat滤波进行处理，得到被增强的图像前景。
S4：将得到的前景与背景融合，得到增强的细胞图像。
S5：由于孔板细胞显微拍照得到的图像中可能包含一些噪声，为了避免噪声对后续图像处理的影响，利用高斯滤波对增强后的细胞图像进行去噪处理。
S6：使用Otsu算法，对处理后的图像进行分割，得到细胞目标。
S7：由于孔板显微拍照图像中可能包含一些杂质或者已经死亡的细胞，所以利用每个细胞目标的最小外接矩形计算每个目标的形状因子，进行合格细胞的鉴定，当形状因子小于指定阈值时鉴定为合格细胞。
S8：由于最终希望确定的是每个孔板中是...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨超颖，刘静，王彦鹏，王泽元，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43