光控螺吡喃整体柱的制备及在细胞代谢物检测中的应用制造技术

光控螺吡喃整体柱的制备及在细胞代谢物检测中的应用，属于分析化学与生物化学领域。该系统包括：光控螺吡喃整体柱的制备、光控单元的搭建及高效液相色谱与质谱联用系统。将丙烯酰基螺吡喃、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、致孔剂按比例配成有机预聚合溶液，然后向活化及烷基化后的毛细管内注入螺吡喃预聚合溶液。在一定水浴温度下引发热聚合制备光控螺吡喃整体柱，该整体柱具有光控极性转换特性；通过将整体柱接入液质联用系统中可实现在可见光与紫外光先后照射下整体柱极性转变进而对A549细胞代谢物分离与检测，最终在可见光条件下实现对A549细胞中能量分子如ATP、ADP的检测，紫外光下三羧酸循环中间体、戊糖磷酸循环中间体的选择性检测。

【技术实现步骤摘要】
光控螺吡喃整体柱的制备及在细胞代谢物检测中的应用
本专利技术涉及一种光控螺吡喃整体柱的制备及在细胞代谢物检测中的应用，属于分析化学与生物化学领域。
技术介绍
代谢组学是继基因组学、转录组学与蛋白质组学后又一新兴领域，主要通过对代谢物的定性与定量分析，实现对生物体体内动态水平的监控。色谱技术因其具有较强的分离能力被广泛的用于代谢物的分离。可以根据代谢物的种类不同，可以选择不同的分离方法。通常情况下，反相液相色谱适用于分离非极性及弱极性代谢物，亲水作用色谱适用于分离极性较强的代谢物。然而到目前为止，还没有一种单一的色谱柱能够实现对样品中全极性的代谢物的分离。因此，由于分离不充分而带来的离子抑制效应将不可避免对微量代谢物的检测产生影响。螺吡喃化合物是指一个带有SP3碳原子相连接的芳香环，通过SP3碳原子与另一个吡喃环相连接的一类具有光致变色性质的有机化合物的统称。在紫外光照射下，螺吡喃分子发生闭环体与开环体之间的可逆转变，伴随化合物极性、颜色与荧光性质发生改变。利用螺吡喃化合物的这一性质结合荧光显微镜与紫外分光光度计等仪器，可以实现含S、F等亲核性较强的代谢物的高灵敏度、高选择性检测。然而，利用螺吡喃分子制备毛细管整体柱，通过光控快速改变整体柱极性进而实现在一次进样中先后分离检测不同极性的细胞代谢物的技术尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术制备了光控螺吡喃整体柱并用于A549细胞代谢物的检测。基于螺吡喃化合物在不同波长光照条件下，分子本身发生闭环体与开环体的可逆转变，从而对不同极性的代谢物分子进行选择性的吸附与分离。应用此系统实现在可见光下对A549细胞内能量分子如ATP、ADP等的分离检测，紫外光下实现对三羧酸循环中间体、戊糖磷酸循环中间体的选择性分离检测。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种光控螺吡喃整体柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以1，4-丁二醇、异丙醇、氯仿为制孔剂，二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、丙烯酰基螺吡喃为单体，制孔剂、单体并加入引发剂，注入到烷基化后的毛细管中并在50-70℃水浴下引发热聚合，制备光控丙烯酰基螺吡喃整体柱；使用的丙烯酰基螺吡喃单体的合成过程如下：①取2，3，3-三甲基吲哚(1.0eq)，2-溴乙醇(1.2eq)加入到盛有无水乙腈的三颈烧瓶中，氮气保护下，回流24h，冷却至室温，旋干剩余溶剂，粗产物在乙醚：三氯甲烷体积比＝1：1的溶液中重结晶，得到粉红色固体产物1；②取产物1(1.0eq)溶于盛有超纯水的圆底烧瓶中，在冰浴条件下，加入KOH(1.6eq)，待溶液变成黄色，在室温下搅拌30min，使用乙酸乙酯进行萃取，无水硫酸钠干燥，有机相浓缩得黄色油状产物2；③取产物2(1.0eq)于盛有溶解在无水乙醇中的5-硝基水杨醛(1.3eq)的三颈烧瓶中，氮气保护下，回流4h，冷却至室温，过滤，使用乙醇清洗，干燥，得到紫红色固体产物3；④取产物3(1.0eq)于盛有二氯甲烷的三颈烧瓶中，滴加溶解在二氯甲烷中的丙烯酰氯(1.3eq)室温搅拌6h，反应结束后用水进行洗涤，收集二氯甲烷层，无水硫酸钠干燥，使用乙酸乙酯：正己烷体积比＝1：5作为流动相过柱，收集Rf值为0.7的组分。整体柱制备时，其单体与制孔剂的质量比例为1：2；单体EDMA与丙烯酰基螺吡喃的质量比例为1：1，制孔剂1，4-丁二醇，异丙醇、氯仿的质量比例为5：5：10，使用的引发剂为偶氮二异丁腈，聚合时间为5～7h。使用的毛细管的规格为内径50～100μm，外径160～360μm，外表面有聚乙烯涂层。所述制备的光控螺吡喃整体柱在细胞代谢物检测中的应用，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、细胞代谢物样品的制备：将培养A549细胞的6孔板置于冰上，加入萃取溶剂后移至冰箱-20℃放置5min对细胞内的代谢物进行萃取，使用细胞刮刀将细胞从壁上刮下，转移细胞悬浮液至离心管中，离心(12000rpm，4℃，10min)，收集上层清液于离心管中待用。步骤二、细胞代谢物的可见光分离检测：将制备的光控螺吡喃整体柱，搭建高效液相色谱质谱系统，利用光控螺吡喃整体柱在可见光照射300s后进行可见光下A549细胞代谢物的分离与检测；步骤三、细胞代谢物的紫外光分离检测：对进行过步骤二的光控螺吡喃整体柱进行紫外光照240s(λ＝365nm,2x6W)后，进行A549细胞代谢物的分离与检测。步骤一中A549细胞接种于6孔板时，细胞密度为3×105/孔。步骤一中接种后的细胞要在37℃，CO2含量为5％的培养箱中培养48h。步骤一中进行A549细胞萃取时，萃取溶剂为异丙醇。步骤二与步骤三中，使用的光控螺吡喃整体柱与液质联用系统联用：包括进样系统、压力系统、分离系统与检测系统等4部分组成；将盛有代谢物的进样瓶置于4℃的样品台上，进样体积为1μL，在流动相的驱动下将样品引入光控螺吡喃整体柱中进行代谢物的分离，在整体柱出口端连接弹性石英毛细管等内径喷针，实现纳升流速样品的电喷雾电离，在质谱正离子模式下进行检测。步骤二与步骤三中，使用的流动相为体积比为1:1的甲醇/水溶液。步骤二与步骤三中使用的流速为0.15μL/min。步骤二中的可见光采用白炽灯(2x6W)，步骤三中的紫外光采用365nm紫外灯(2x6W)。采用双光源对向辐照设计，保证整体柱全方位均匀受光。本专利技术可以获得如下效果：本专利技术制备了光控螺吡喃整体柱，并用于A549细胞代谢物的分离检测。该系统中，采用该方法在可见光下实现了对A549细胞中能量分子的检测，紫外光下可以选择性的检测到三羧酸循环中间体、戊糖磷酸循环中间体。将分离不同种类的代谢物，有效的降低了离子抑制效应对检测微量代谢物的影响，是一种分离与检测代谢物中微量物质的良好方法。与传统液质联用方法相比在实现小体积进样的同时利用切换整体柱的极性实现对更多种类代谢物的检测。本专利技术中使用丙烯酰基螺吡喃整体柱在紫外光下螺吡喃化合物由闭环体经C-O键异裂，电子组态发生异构化或重排变成开环体部花菁，形成一个大的共轭平面的过程，使得极性发生改变从而实现对细胞中氨基酸、脂质、核酸的选择性和特异性吸附，达到分离检测的目的。利用本专利技术中的光控螺吡喃整体柱-液质联用系统对A549细胞代谢物进行分离、检测，分析检测数据得，利用该系统在可见光下根据颜色不同实现对A549细胞中能量分子的分离检测，紫外光下根据颜色不同实现三羧酸循环中间体、戊糖磷酸循环中间体的选择性分离检测。附图说明图1是光控螺吡喃整体柱-液质联用系统联用示意图。图2是可见光与紫外光照射后丙烯酰基螺吡喃的接触角变化情况。图3是异丙醇：1，4-丁二醇：氯仿在5：5：10的比例下聚合不同时间的毛细管整体柱端面的扫描电镜图。图4不同条件下，光控螺吡喃整体柱-液质联用系统检测到代谢物的种类。1.高效液相色谱，2.光控单元，3.弹性石英毛细管等内径喷针，4.质谱，5、8.365nm紫外灯(2x6W)，6、9本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种光控螺吡喃整体柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n以1，4-丁二醇、异丙醇、氯仿为制孔剂，二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、丙烯酰基螺吡喃为单体，制孔剂、单体并加入引发剂，注入到内表面烷基化的毛细管中，在50-70℃水浴下引发热聚合，制备光控丙烯酰基螺吡喃整体柱。/n

【技术特征摘要】
1.一种光控螺吡喃整体柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
以1，4-丁二醇、异丙醇、氯仿为制孔剂，二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、丙烯酰基螺吡喃为单体，制孔剂、单体并加入引发剂，注入到内表面烷基化的毛细管中，在50-70℃水浴下引发热聚合，制备光控丙烯酰基螺吡喃整体柱。


2.按照权利要求1所述的一种光控螺吡喃整体柱的制备方法，其特征在于，
使用的丙烯酰基螺吡喃单体的合成过程如下：①取2，3，3-三甲基吲哚1.0eq、2-溴乙醇1.2eq加入到盛有无水乙腈的三颈烧瓶中，氮气保护下，回流24h，冷却至室温，旋干剩余溶剂，粗产物在乙醚：三氯甲烷体积比＝1：1的溶液中重结晶，得到粉红色固体产物1；②取产物11.0eq溶于盛有超纯水的圆底烧瓶中，在冰浴条件下，加入KOH1.6eq，待溶液变成黄色，在室温下搅拌30min，使用乙酸乙酯进行萃取，无水硫酸钠干燥，有机相浓缩得黄色油状产物2；③取产物21.0eq于盛有溶解在无水乙醇中的5-硝基水杨醛1.3eq的三颈烧瓶中，氮气保护下，回流4h，冷却至室温，过滤，使用乙醇清洗，干燥，得到紫红色固体产物3；④取产物31.0eq于盛有二氯甲烷的三颈烧瓶中，滴加溶解在二氯甲烷中的丙烯酰氯1.3eq室温搅拌6h，反应结束后用水进行洗涤，收集二氯甲烷层，无水硫酸钠干燥，使用乙酸乙酯：正己烷体积比＝1：5作为流动相过柱，收集Rf值为0.7的组分。


3.按照权利要求1所述的一种光控螺吡喃整体柱的制备方法，其特征在于，整体柱制备时，其丙烯酰基螺吡喃单体与制孔剂的质量比例为1：2；EDMA与丙烯酰基螺吡喃的质量比例为1：1，其中制孔剂1，4-丁二醇，异丙醇、氯仿的质量比例为5：5：10，使用的引发剂为偶氮二异丁腈，聚合时间为5～7h。


4.按照权利要求1所述的一种光控螺吡喃整体柱的制备方法，其特征在于，使用的毛细管的规格为内径50～100μm，外径160～360μm，外表面有聚乙烯涂层。


5.按照权利要求1-3任一项所述的方法制备得到的光控螺吡喃整体柱...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪夏燕，裴彤，刘珍，邵云龙，李利杰，郭广生，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11