一种电化学免疫传感器及其制备方法技术

一种电化学免疫传感器，包括有石墨烯带（GNR）、借助π‑π堆积固定在石墨烯带（GNR）的表面上的3,4,9,10‑苝四羧酸（PTCA）、借助酰胺键固定在石墨烯带（GNR）的表面上的牛血清蛋白（BSA）、借助酰胺键固定在3,4,9,10‑苝四羧酸（PTCA）的表面上的一级抗体（PAb）、金纳米粒子（Au‑NPs）、通过Au‑S键固定在金纳米粒子（Au‑NPs）表面的二茂铁衍生物（Fc‑SH）、借助静电吸附在金纳米粒子（Au‑NPs）表面的二级抗体（SAb）。本发明专利技术PTCA/GNR表面可以固定大量的PAb，从而提高了传感性能；具有良好的分析性能，线性范围宽（10～2×10

【技术实现步骤摘要】
一种电化学免疫传感器及其制备方法
本专利技术涉及一种电化学免疫传感器及其制备方法。
技术介绍
单核细胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes，LM）是一种革兰氏阳性的食源性致病菌，可引起脑膜炎、败血症、流产、发热性胃肠炎等多种严重疾病，其高死亡率（约30%）和高发病率已对人类健康构成严重威胁。一般来说，孕妇、新生儿、免疫功能低下者以及老年人都易感染LM。此外，LM可以在水、土壤、植物、动物或人类粪便中，甚至在恶劣的环境中生存；同时，LM还可以污染大量的食品，如牛奶、肉类、奶酪、生蔬菜、冰淇淋、甜瓜等。LM已被确认为危害生命最严重的病原菌之一。在美国，疾病控制和预防中心估计每年有1000例与李斯特菌病有关的感染，死亡人数超过200人，并且已经形成了对食品中LM存在的零容忍政策；而在加拿大，它只允许食品中含有100CFU/gLM。因此，迫切需要发展敏感和准确的LM检测方法。目前用于LM检测的常规方法有酶联免疫吸附法、聚合酶链反应法、表面等离子体共振法、石英晶体微天平免疫传感器和光纤免疫传感器等。这些方法无疑是非常重要的，能够满足LM检测的需要。然而，它们往往存在着劳动强度大、耗时长、设备昂贵、预处理复杂等缺点。与其他方法相比，电化学方法具有操作简单、成本低廉等优点，已经成功地构建了一些优越的电化学传感平台来检测LM。尽管这些传感平台在LM检测中有着重要的应用，但是灵敏度低和优越性，传感性能低，分析性能差，线性范围窄，检测限高，特异性不够理想。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于：为了克服现有技术的缺陷，本专利技术提出一种电化学免疫传感器及其制备方法。为了解决上述技术问题，本专利技术提出下列技术方案：一种电化学免疫传感器，包括有石墨烯带（GNR）、借助π-π堆积固定在石墨烯带（GNR）的表面上的3,4,9,10-苝四羧酸（PTCA）、借助酰胺键固定在石墨烯带（GNR）的表面上的牛血清蛋白（BSA）、借助酰胺键固定在3,4,9,10-苝四羧酸（PTCA）的表面上的一级抗体（PAb）、金纳米粒子（Au-NPs）、通过Au-S键固定在金纳米粒子（Au-NPs）表面的二茂铁衍生物（Fc-SH）、借助静电吸附在金纳米粒子（Au-NPs）表面的二级抗体（SAb）。上述技术方案的进一步限定在于，3,4,9,10-苝四羧酸（PTCA）固定在石墨烯带（GNR）上形成亲水的3,4,9,10-苝四羧酸/石墨烯（PTCA/GNR）纳米杂化物，作为传感平台。上述技术方案的进一步限定在于，将Fc衍生物（Fc-SH）和二级抗体（SAb）分别通过Au-S键和静电吸附组装在Au-NPs表面，作为信号放大器（SAb-Au-NPs-Fc）。为了解决上述技术问题，本专利技术提出下列技术方案：一种电化学免疫传感器的制备方法，其包括如下步骤：步骤1：PTCA/GNR的制备，具体如下：将50.0mg碳纳米管（CNT）分散在玻璃瓶中的浓H2SO4/H3PO4（体积比9:1）中搅拌1h，然后添加250.0mgKMnO4；将形成的混合物加热至65℃并保持2小时，然后将其倒入含有H2O2的冰水中以使反应猝灭；经过过滤、洗涤和干燥，得到了初始的氧化石墨烯纳米带（GONR）；在GONR分散液中加入氨水和联氨溶液，在60℃搅拌下加热10h，过滤和洗涤后可获得GNR；将50.0mgGNR在含有20.0mgPTCA的100.0mL乙醇中超声处理1h，并且在室温下将溶液连续搅拌2h，得到的混合物通过尼龙膜（0.22mm）过滤，洗涤几次并干燥，从而形成PTCA/GNR；步骤2：SAb-AuNPs-Fc的制备，具体如下：将0.2molL−1柠檬酸钠（400μL）逐滴添加到0.2mgmL−1HAuCl4溶液（12.0mL）中，并在60℃下加热2小时，离心得到金纳米粒子并干燥；在1.0mL金纳米粒子溶液中加入20.0μLSAb孵育2小时，然后在SAb金纳米粒子溶液中加入1.0mMFc-SH溶液（20.0μL），得到SAb-AuNPs-Fc；步骤3：BSA/PAb/PTCA/GNR/GCE的制备，具体如下：在抛光的玻璃碳电极（GCE）表面滴加12.0μLPTCA/GNR悬浮液（0.5mgmL−1），并用碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）混合物处理以激活羧基；在活化后的PTCA/GNR/GCE表面滴加12.0μL一级抗体（PAb），记作PAb/PTCA/GNR/GCE；然后用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗PAb/PTCA/GNR/GCE，除去未结合的PAb，同时与牛血清蛋白（BSA）孵育，制备BSA/PAb/PTCA/GNR/GCE；步骤4：SAb-Au-NPs-Fc的制备，具体如下：将0.2molL−1柠檬酸钠（400μL）逐滴添加到0.2mgmL−1HAuCl4溶液（12.0mL）中，并在60℃下加热2小时，离心得到金纳米粒子AuNPs并干燥；接着，在1.0mL金纳米粒子溶液中加入20.0μLSAb（0.05mgmL-1）孵育2小时，然后在SAb金纳米粒子溶液中加入1.0mMFc-SH溶液（20.0μL），即得到SAb-AuNPs-Fc。与现有技术相比，本专利技术具有下列有益效果：通过引入3,4,9,10-苝四羧酸/石墨烯（PTCA/GNR）纳米杂化物作为传感平台，二茂铁/金纳米粒子（Fc/Au-NPs）作为信号放大器，提出了一种新型的三明治型LM电化学免疫传感器。GNR的高导电性和大表面积可以增加一级抗体（PAb）的固定量，提高电子传递速率，而Au-NPs可以携带二级抗体（SAb）和Fc衍生物（Fc-SH）形成SAb-Au-NPs-Fc信号放大器。以Fc分子为信号探针，其峰值电流随LM浓度的变化而出现和增加，构建了一种高灵敏度的夹心型免疫传感器，线性范围为10to2×104CFUmL-1，检测限为6CFUmL-1。此外，还对该免疫传感器的特异性进行了研究，得到了满意的结果。附图说明图1为本专利技术电化学免疫传感器的制备方法示意图。图2为CNT、GNR和AuNPs在透射电子显微镜下的图像。图3是GNR(a)和PTCA/GNR(b)的傅里叶红外图谱。图4是GNR(a)和PTCA/GNR(b)在水中分散的照片。图5是PTCA/GNR/GCE(a)，BSA/PAb/PTCA/GNR/GCE(b)，LM/BSA/PAb/PTCA/GNR/GCE(c)和SAb-AuNPs-Fc/LM/BSA/PAb/PTCA/GNR/GCE(d)的电化学阻抗谱。图6是SAb-AuNPs-Fc/LM/BSA/PAb/PTCA/GNR/GCE在0.1M磷酸缓冲溶液中的差分脉冲信号。LM的浓度是1.4×104CFUmL-1。图7是传感条件的优化实验：(A)磷酸缓冲溶液的pH；(B)PTCA/GNR的用量；(C)LM和BSA/PAb/PTCA/GNR/GCE的作用时间(a)及LM/BSA/PAb/PTCA/GNR/GCE和SAb-AuNPs-Fc的作用时间(b本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种电化学免疫传感器，其特征在于，其包括有石墨烯带（GNR）、借助π-π堆积固定在石墨烯带（GNR）的表面上的3,4,9,10-苝四羧酸（PTCA）、借助酰胺键固定在石墨烯带（GNR）的表面上的牛血清蛋白（BSA）、借助酰胺键固定在3,4,9,10-苝四羧酸（PTCA）的表面上的一级抗体（PAb）、金纳米粒子（Au-NPs）、通过Au-S键固定在金纳米粒子（Au-NPs）表面的二茂铁衍生物（Fc-SH）、借助静电吸附在金纳米粒子（Au-NPs）表面的二级抗体（SAb）。/n

【技术特征摘要】
1.一种电化学免疫传感器，其特征在于，其包括有石墨烯带（GNR）、借助π-π堆积固定在石墨烯带（GNR）的表面上的3,4,9,10-苝四羧酸（PTCA）、借助酰胺键固定在石墨烯带（GNR）的表面上的牛血清蛋白（BSA）、借助酰胺键固定在3,4,9,10-苝四羧酸（PTCA）的表面上的一级抗体（PAb）、金纳米粒子（Au-NPs）、通过Au-S键固定在金纳米粒子（Au-NPs）表面的二茂铁衍生物（Fc-SH）、借助静电吸附在金纳米粒子（Au-NPs）表面的二级抗体（SAb）。


2.根据权利要求1所述的电化学免疫传感器，其特征在于，3,4,9,10-苝四羧酸（PTCA）固定在石墨烯带（GNR）上形成亲水的3,4,9,10-苝四羧酸/石墨烯（PTCA/GNR）纳米杂化物，作为传感平台。


3.根据权利要求1所述的电化学免疫传感器，其特征在于，将Fc衍生物（Fc-SH）和二级抗体（SAb）分别通过Au-S键和静电吸附组装在Au-NPs表面，作为信号放大器（SAb-Au-NPs-Fc）。


4.一种如权利要求1所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
步骤1：PTCA/GNR的制备，具体如下：
将50.0mg碳纳米管（CNT）分散在玻璃瓶中的浓H2SO4/H3PO4（体积比9:1）中搅拌1h，然后添加250.0mgKMnO4；将形成的混合物加热至65℃并保持2小时，然后将其倒入含有H2O2的冰水中以使反应猝灭；经过过滤、洗涤和干燥，得到了初始的氧化石墨烯纳米带（GONR）；在GONR分散液中加入氨水和联氨溶液，在60℃搅拌下加热10h，过滤和洗涤后可获得GNR；
将50.0mgGNR...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋晓华，丁文捷，吕智文，
申请(专利权)人：深圳职业技术学院，
类型：发明
国别省市：广东;44