一种纸基双模淀粉样蛋白生物传感器的制备方法技术

本发明专利技术提供一种高性能纸基双模淀粉样蛋白生物传感器的制备方法，属于生物传感器制备技术领域。在该发明专利技术过程中，制备了一种新型的纸质分析装置(oPAD)，该装置借助Pd修饰Cu/Co掺杂的CeO

【技术实现步骤摘要】
一种纸基双模淀粉样蛋白生物传感器的制备方法
本专利技术涉及一种纸基双模淀粉样蛋白生物传感器的制备方法，属于生物传感器制备的

技术介绍
具有氨基酸残基的淀粉样蛋白聚集可引起神经元损伤，并进一步导致相关症状的产生。开发用于体液中淀粉样蛋白检测的新协议和策略，并最终以超灵敏，具有成本效益的便携式设备实施针对老年人的淀粉样蛋白检测方法至关重要。为了满足淀粉样蛋白分析策略的迫切需求，一些技术包括荧光技术，表面增强拉曼光谱，酶联免疫吸附等方法已被开发出来。虽然已经取得了一定的进展，但在早期诊断的分析设备开发中仍然存在诸多技术挑战，例如复杂的仪器要求，操作繁杂的处理程序，定量测量的灵敏度低等，这些都增加了常规且快速检测的难度。纸基分析装置具有纸纤维素的优点，如成本低，储量丰富，易功能化和绿色生物降解等，因此在护理诊断中引起了极大的关注。鉴于其吸引人的特性，纸质分析设备已与各种技术集成在一起，例如纸基荧光法，纸基电化学发光和纸基比色法等，已成功用于环境监测，能量存储应用等方面。特别是，将电化学技术与纸质分析设备相结合，由于其高灵敏度，高选择性和简便性，使其与其他方法相比更具吸引力，并成为检测淀粉样蛋白的潜在分析方法。
技术实现思路
针对目前存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种设计合理，成本低廉，操作简便且灵敏度高的纸基双模淀粉样蛋白生物传感器的制备方法，其特征是包括以下步骤：(1)可溶性淀粉样蛋白的制备:首先通过将冻干的淀粉样蛋白肽溶解在1,1,1,3,3,3,3-六氟-2-丙醇中并超声处理10min来获得淀粉样蛋白，然后将获得的产物重新溶解到20mM氢氧化钠溶液中，得到的浓度为2-3mM，通过用10-20mM，pH2.0的磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为50-60µM，进一步用2-3mM，pH7.2-7.5的磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度制备样品，以便在25℃下进行进一步实验；(2)Ab2/CuCo-CeO2-Pd生物共轭物的制备：首先将1.0-1.5mgCuCo-CeO2-Pd纳米球分散到200-300μLpH7.4的磷酸盐缓冲液中，然后转移到200-300μL1.0μg/mL的Ab2的溶液中并在4℃持续孵育24h，然后通过离心收集制备的Ab2/CuCo-CeO2-Pd生物缀合物，并进一步用pH7.4的磷酸盐缓冲液洗涤，为了阻止表面非特异性活性位点，一旦获得Ab2/CuCo-CeO2-Pd生物缀合物，就将100-150μL的1.0％-1.5%的牛血清白蛋白添加到获得的产物中，并在4℃下振动3h，然后用pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗掉多余的牛血清白蛋白，再将制备的生物结合物储存在pH7.4的磷酸盐缓冲液中，存在4℃下进行下一步的实验；(3)设计组装纸基生物传感器：在计算机上利用AdobeIllustratorCS6软件设计一个疏水蜡打印图案并利用喷蜡打印机将其批量打印到裁剪的A4尺寸滤纸上，基于丝网印刷技术，在相应的未印刷的圆形区域纸纤维上印刷工作电极，对电极和参比电极，样式如附图1所示，为了最终完成纸基生物传感器三维结构的组装，使用剃刀将打印的纸张切割成不同的单个标签，然后沿着两个标签之间的连接空间折叠各个标签；(4)检测区域的功能化：首先通过种子溶液生长法生长金纳米粒子，具体生长步骤为：首先将80-100mL二次水倒入三口烧瓶中加热至90℃，并加入500-1000μL质量分数为1%-2%的氯金酸溶液，继续加热至96℃保持1min，最后加入2.0-3.0mL质量分数为1%的柠檬酸钠，继续加热15min，自然冷却得到金种子溶液，取50-100μL得到的金种子溶液滴加在工作区域，静置晾干，重复三次，用二次水冲洗3次，然后，将25μL的20-25μg/mLAb1滴到制备的金-纸电极上，并在4℃下孵育12h，用pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗3次后，将生成的电极在室温下用25μL，2.0％-3.0%的牛血清白蛋白封闭2h，为了实现电化学信号放大，通过抗原-抗体的特异性相互作用将预先制备为Ab2/CuCo-CeO2-Pd生物缀合物的CuCo-CeO2-Pd探针引入系统中，其中CuCo-CeO2-Pd的独特催化性能有助于有效提高生物分析过程中目标检测的灵敏度，随后，用pH7.0的磷酸盐缓冲液平稳清洗检测区域的金-纸电极，以去除未结合的Ab2/CuCo-CeO2-Pd生物缀合物；(5)显色反应的预处理：在圆形亲水区域中加入10μLpH为7.4，浓度为0.1-0.5M的磷酸盐缓冲液，然后将200μL浓度为5-8mM的过氧化氢溶液滴加到圆形亲水区域，然后在显色区域预埋20μL浓度为20-30mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色液；(6)电化学信号的检测：首先通过折叠将检测区域，参比电极和对电极区域，分流区域重叠，清洗区域置于显色区域的下面，完成电极的层层修饰后，对工作区域进行清洗，使检测区和电极标签重叠，用夹子固定，样式如附图2所示，与电化学工作站连接，将60μL含有5.0-6.0mM[Fe(CN)6]3-/4-pH为7.4，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液滴加到检测区域，进行测定并记录；(7)显色信号的测定：电信号测量过程完成后，将清洁标签抽掉，样式如附图3所示，过氧化氢和信号探针流过分流区域分别流到显色区域和对比区域并与预埋在显色区域的3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色液反应，以实现可视化检测。步骤（3）中所述纸芯片的设计，其特征在于：清洁区域为疏水区，尺寸为12mm×12mm，工作电极区域直径为10mm，修饰区域直径为8mm，参比电极和对电极印刷区域直径为10mm，设计构造了一个分流区域，直径为10mm，可以实现反应液的分流，使其分别流到显色区域和对比区域进行显色反应的对比，显色区域和对比区域直径为10mm，清洗标签中废液池的尺寸为18mm×8mm，可以实现电极修饰过程中的多次清洗。本专利技术的有益效果：（1）一种纸基双模淀粉样蛋白生物传感器的制备方法，降低了实验成本。（2）信号探针的引入极大地提高了检测的选择性和灵敏度。（3）纸基金纳米颗粒的功能化，可有效增大其比表面积，提高了检测灵敏度。（4）纸基传感器柔韧灵活，携带方便，可以剪裁、弯曲、折叠和可塑，后处理简单，不会对环境造成污染。（5）相比于传统的玻碳电极和玻璃电极，纸基材原料丰富、质量轻、廉价、易折叠、可降解。（6）纸基生物传感器实现了电极的自清洗过程，简化操作步骤，节约电极修饰时间。附图说明：下面结合附图和具体实施方案对本专利技术作进一步详细描述：附图1是疏水蜡打印图案上丝网印刷工作电极、参比电极、对电极、碳线。附图2是纸基设备电化学模式检测目标物折叠示意图。附图3是纸基设备显色模式检测目标物折叠示意图。具体实施方式一种设计合理，成本低廉，操作简便且灵敏度高的纸基双模淀粉样蛋白生物传感器的制备方法，其特征是包括以下步骤：(1)可溶性淀粉样蛋白的制备:首先通过将冻干的淀粉样蛋白肽溶解本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高性能纸基双模淀粉样蛋白生物传感器的制备方法，其特征是包括以下步骤：/n(1) 可溶性淀粉样蛋白的制备:首先通过将冻干的淀粉样蛋白肽溶解在1,1,1,3,3,3,3-六氟-2-丙醇中并超声处理10 min来获得淀粉样蛋白，然后将获得的产物重新溶解到20mM氢氧化钠溶液中，得到的浓度为2 mM，通过用10 mM，pH 2.0的磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为50 μM，进一步用2 mM，pH 7.2的磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度制备样品，以便在25 ℃下进行进一步实验；/n(2) Ab2/CuCo-CeO

【技术特征摘要】
1.一种高性能纸基双模淀粉样蛋白生物传感器的制备方法，其特征是包括以下步骤：
(1)可溶性淀粉样蛋白的制备:首先通过将冻干的淀粉样蛋白肽溶解在1,1,1,3,3,3,3-六氟-2-丙醇中并超声处理10min来获得淀粉样蛋白，然后将获得的产物重新溶解到20mM氢氧化钠溶液中，得到的浓度为2mM，通过用10mM，pH2.0的磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为50μM，进一步用2mM，pH7.2的磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度制备样品，以便在25℃下进行进一步实验；
(2)Ab2/CuCo-CeO2-Pd生物共轭物的制备：首先将1.0mgCuCo-CeO2-Pd纳米球分散到250μLpH7.4的PBS溶液中，然后转移到250μL1.0μg/mL的Ab2的溶液中并在4℃持续孵育24h，然后通过离心收集制备的Ab2/CuCo-CeO2-Pd生物缀合物，并进一步用pH7.4的2mM洗涤，为了阻止表面非特异性活性位点，一旦获得Ab2/CuCo-CeO2-Pd生物缀合物，就将150μL的1.0％牛血清白蛋白添加到获得的产物中，并在4℃下振动3h，然后用pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗掉多余的牛血清白蛋白，再将制备的生物结合物储存在pH7.4的磷酸盐缓冲液中，以在4℃下进行下一步的实验；
(3)设计组装纸基生物传感器：在计算机上利用AdobeIllustratorCS6软件设计一个疏水蜡打印图案并利用喷蜡打印机将其批量打印到裁剪的A4尺寸滤纸上，基于丝网印刷技术，在相应的未印刷的圆形区域纸纤维上印刷工作电极，对电极和参比电极，为了最终完成纸基生物传感器三维结构的组装，使用剃刀将打印的纸张切割成不同的单个标签，然后沿着两个标签之间的连接空间折叠各个标签；
(4)检测区域的功能化：首先通过种子溶液生长法生长金纳米粒子，具体生长步骤为：首先将80mL二次水倒入三口烧瓶中加热至90℃，并加入800μL质量分数为1%的氯金酸溶液，继续加热至96℃保持1min，最后加入2.8mL质量分数为1%的柠檬酸钠，继续加热15min，自然冷却得到金种子溶液，取60μL得到的金种子溶液滴加在工作区域，静置晾干，重复三次，用二次水冲洗3次，然...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔康，周晨曦，李旭，于京华，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37