一种抗多房棘球绦虫原头蚴抗原单克隆抗体的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种抗多房棘球绦虫原头蚴抗原单克隆抗体的制备方法及其应用，属于生物技术及细胞工程领域。本发明专利技术通过杂交瘤技术采用Balb/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合建立杂交瘤细胞株。由上述细胞通过体外培养法、动物体内诱生腹水法制备单克隆抗体；制备了泡球蚴免疫荧光试剂盒。本发明专利技术为临床和科研机构提供了抗多房棘球绦虫原头蚴抗原的特异性单克隆抗体，它既可用于ELISA试验对临床样品进行检测，也可用于免疫组化试验对病理标本进行临床诊断，还可为包虫病研究部门提供便利的研究工具，在多房棘球蚴病的诊断、检测中有广泛的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种抗多房棘球绦虫原头蚴抗原单克隆抗体的制备方法及其应用
本专利技术属于生物及细胞工程
，涉及一种抗多房棘球绦虫原头蚴抗原单克隆抗体的制备方法及其应用。
技术介绍
多房棘球蚴病又称泡型包虫病(AE)，是一种由多房棘球绦虫的幼虫(多房棘球蚴或泡球蚴)寄生于动物或人体内而致的重要人畜共患寄生虫病。多房棘球蚴早期寄生于中间宿主的肝内，导致局部肝组织病变、增生、纤维化、萎缩、变性和坏死，而临床症状不明显；晚期似肝癌样转移，可转移至肺、脑、乳腺等脏器而被称为“虫癌”，若不及时治疗，10年病死率高达94％，因此泡型包虫病已成为人类致死率最高的慢性感染性疾病之一。泡型包虫病主要分布在北半球，成局部地方性流行趋势，在我国主要分布于新疆、青海、西藏、四川、甘肃和宁夏等西部省区及内蒙古。我国西部牧区野生狐狸、放牧犬和啮齿类动物分布广泛，使得多房棘球绦虫生活史循环链存在复杂性，进一步增加了宿主动物和人传播和感染该病的风险，尤其在一些偏远牧区人群发病率高达10％。目前主要使用B超、CT、X射线和磁共振(MRI)等影像学方法以及酶联免疫吸附实验(ELISA)和蛋白质印迹(Westernblotting)等免疫学实验对该病进行检测。影像学检查时，AE的一些非典型和体积较小的病灶常与肝癌和肝脓肿等相混淆，而血清学检测则因使用的抗原为粗抗原导致敏感性和特异性较差，常与及其他寄生虫抗原存在交叉反应。在针对多房棘球蚴病进行的科研工作中，也常常需要能和多房棘球绦虫原头蚴抗原特异性结合的抗体作为研究工具，来确定泡球蚴的定性定位情况。抗多房棘球绦虫原头蚴抗原单克隆抗体也是进行检测试剂盒研发工作中必不可少的工具。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗多房棘球绦虫原头蚴抗原单克隆抗体的制备方法及其应用。1、本专利技术的目的是提供能分泌抗多房棘球绦虫原头蚴抗原特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2、本专利技术的另一目的是提供由上述细胞株分泌的抗多房棘球绦虫原头蚴抗原的特异性单克隆抗体。3、本专利技术的另一目的是上述单克隆抗体在多房棘球蚴病诊断和检测上的可能应用。其技术方案如下：一种抗多房棘球绦虫原头蚴抗原单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：步骤1、建立细胞株(1)抗原制备材料：泡球蚴感染的昆明鼠，培养皿、手术器械、研钵灭菌备用、医用纱布、50mL离心管、5mL离心管、1.5mL离心管、0.9％氯化钠注射液，细胞超声波粉碎仪(宁波新芝JY92-II)。步骤：采用泡球蚴感染的昆明鼠颈部脱臼致死。75％乙醇浸泡15min体表消毒。按解剖层次开腹。剪取腹腔内生长良好的泡球蚴组织放入培养皿中加入0.9％氯化钠注射液6mL。用眼科剪小心去除泡球蚴表面的宿主组织和血管，将泡球蚴放入灭菌处理的研钵中。用研钵杵破碎组织，经医用纱布过滤，去除囊壁和多余杂质。原头蚴过滤进50mL离心管中，加入0.9％氯化钠注射液25mL混匀，自然沉淀去除上清，反复5次，以洗去泡球蚴囊液、囊壁和杂质。取3mL原头蚴装入5mL离心管中，在冰浴条件下，放入超声波细胞破碎仪中600w，超声3s，间隔6s，共超声5min后可见清亮液体。将超声破碎后的悬混液分装进1.5mL离心管内，3500rpm/min，4℃离心10min，收集上清，即为提取的蛋白。用BCA蛋白定量试剂盒(北京博迈德科技发展有限公司)测定所获上清蛋白浓度。(2)免疫小鼠材料：试验1所准备的原头蚴抗原、选择与所用骨髓瘤细胞同源的Balb/c健康雌性小鼠(购自新疆实验动物中心)，鼠龄在6～8周。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂(Sigma公司)。步骤：初次免疫：原头蚴抗原加等体积弗氏完全佐剂，乳化到滴水不扩散即可，做小鼠背部皮下多点注射，注射体积200μL(100μg抗原)/只小鼠，两周后进行第二次免疫。第二次免疫：取原头蚴抗原加等体积弗氏不完全佐剂，乳化到滴水不扩散即可，做小鼠背部皮下多点注射，注射体积200μL(50μg抗原)/只小鼠，两周后进行第三次免疫。第三次免疫：取原头蚴抗原加等体积弗氏不完全佐剂，乳化到滴水不扩散即可，做小鼠背部皮下多点注射，注射体积200μL(50μg抗原)/只小鼠。加强免疫：采上述小鼠尾静脉血离心取血清测效价(用ELISA方法检测)，效价达1:80000以上的小鼠融合前三天取原头蚴抗原加强免疫，腹腔注射体积200μL(100μg抗原)/只小鼠。(3)饲养细胞的制备材料：Balb/c小鼠1只、消毒备用的手术器械、超净工作台，RPMI-1640基础培养液、RPMI-1640完全培养液：RPMI-1640基础培养液40mL加入10mL胎牛血清、100×青霉素-链霉素、100×L-谷氨酰胺(Hyclone公司)，50×HAT储备液、HAT选择培养液：完全培养液49mL加入1mL50倍HAT储备液(Sigma公司)。步骤：融合前1d选择一只健康的Balb/c鼠安乐死，浸泡于75％的酒精中3min，随即放入生物安全柜中，腹部朝上固定于解剖板上。用眼科镊子提起小鼠腹部皮肤，用无菌眼科剪剪开腹部皮肤，经钝性剥离使腹膜充分暴露。用酒精棉球擦拭腹膜消毒，用5mL一次性注射器吸取RPMI-1640基础培养液，注入小鼠腹腔，注射器停留不动，反复抽吸几次，用原注射器吸出腹腔内液体，注入15mL离心管中。1000rpm离心5min，弃上清，加入适量HAT选择培养液重悬细胞并稀释1×105/mL，放入96孔细胞培养板中，100μL/孔，铺板5块板，放置在37℃，5％CO2培养箱中，24h内密切观察细胞生长情况。(4)骨髓瘤细胞的准备材料：骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)，RPMI-1640基础培养液、RPMI-1640完全培养液：RPMI-1640基础培养液40mL加入10mL胎牛血清、100×青霉素-链霉素、100×L-谷氨酰胺(Hyclone公司)，8-氮鸟嘌呤(Sigma公司)。步骤：骨髓瘤细胞选取SP2/0细胞(本实验室液氮冻存)。融合前20～30d，进行SP2/0细胞的复苏。经过8-氮鸟嘌呤(Sigma公司)筛选，放入75cm2细胞培养瓶中扩大培养。试验时选取处于对数生长期的、形态良好的、活细胞计数超过95％的骨髓瘤细胞，将其完全吹下，转移到50mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，再用RPMI-1640洗涤2次。加RPMI-1640至20mL计数，取2×107个细胞待用。(5)脾细胞制备取加强免疫3d后的小鼠一只安乐死，浸泡于75％的酒精中3min，随即放入生物安全柜中取出脾脏，去除结缔组织。用RPMI-1640培养液冲洗一次，碾碎，过200目网筛，用10mLRPMI-1640培养液冲洗网筛，制成细胞悬液后转移到50mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清。加入4℃预冷的0.91％NH4Cl，混匀，冰浴静置5min。加入15mLRPMI-1640基础培养液终止NH4Cl作用，1000rpm，离心5min，弃上清，再用RPMI-164本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗多房棘球绦虫原头蚴抗原单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1、建立细胞株/n(1)抗原制备/n材料：泡球蚴感染的昆明鼠，培养皿、手术器械、研钵灭菌备用、医用纱布、50mL离心管、5mL离心管、1.5mL离心管、0.9％氯化钠注射液，细胞超声波粉碎仪；/n步骤：采用泡球蚴感染的昆明鼠颈部脱臼致死；75％乙醇浸泡15min体表消毒；按解剖层次开腹；剪取腹腔内生长良好的泡球蚴组织放入培养皿中加入0.9％氯化钠注射液6mL；用眼科剪小心去除泡球蚴表面的宿主组织和血管，将泡球蚴放入灭菌处理的研钵中；/n用研钵杵破碎组织，经医用纱布过滤，去除囊壁和多余杂质；原头蚴过滤进50mL离心管中，加入0.9％氯化钠注射液25mL混匀，自然沉淀去除上清，反复5次，以洗去泡球蚴囊液、囊壁和杂质；取3mL原头蚴装入5mL离心管中，在冰浴条件下，放入超声波细胞破碎仪中600w，超声3s，间隔6s，共超声5min后见清亮液体；将超声破碎后的悬混液分装进1.5mL离心管内，3500rpm/min，4℃离心10min，收集上清，即为提取的蛋白；用BCA蛋白定量试剂盒测定所获上清蛋白浓度；/n(2)免疫小鼠/n材料：试验1所准备的原头蚴抗原、选择与所用骨髓瘤细胞同源的Balb/c健康雌性小鼠，鼠龄在6～8周；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂；/n步骤：初次免疫：原头蚴抗原加等体积弗氏完全佐剂，乳化到滴水不扩散，做小鼠背部皮下多点注射，注射体积200μL/只小鼠，两周后进行第二次免疫；/n第二次免疫：取原头蚴抗原加等体积弗氏不完全佐剂，乳化到滴水不扩散，做小鼠背部皮下多点注射，注射体积200μL/只小鼠，两周后进行第三次免疫；/n第三次免疫：取原头蚴抗原加等体积弗氏不完全佐剂，乳化到滴水不扩散，做小鼠背部皮下多点注射，注射体积200μL/只小鼠；/n加强免疫：采上述小鼠尾静脉血离心取血清测效价，效价达1:80000以上的小鼠融合前三天取原头蚴抗原加强免疫，腹腔注射体积200μL/只小鼠；/n(3)饲养细胞的制备/n材料：Balb/c小鼠1只、消毒备用的手术器械、超净工作台，RPMI-1640基础培养液、RPMI-1640完全培养液：RPMI-1640基础培养液40mL加入10mL胎牛血清、100×青霉素-链霉素、100×L-谷氨酰胺，50×HAT储备液、HAT选择培养液：完全培养液49mL加入1mL50倍HAT储备液；/n步骤：融合前1d选择一只健康的Balb/c鼠安乐死，浸泡于75％的酒精中3min，随即放入生物安全柜中，腹部朝上固定于解剖板上；用眼科镊子提起小鼠腹部皮肤，用无菌眼科剪剪开腹部皮肤，经钝性剥离使腹膜充分暴露；用酒精棉球擦拭腹膜消毒，用5mL一次性注射器吸取RPMI-1640基础培养液，注入小鼠腹腔，注射器停留不动，反复抽吸几次，用原注射器吸出腹腔内液体，注入15mL离心管中；1000rpm离心5min，弃上清，加入适量HAT选择培养液重悬细胞并稀释1×10...

【技术特征摘要】
1.一种抗多房棘球绦虫原头蚴抗原单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、建立细胞株
(1)抗原制备
材料：泡球蚴感染的昆明鼠，培养皿、手术器械、研钵灭菌备用、医用纱布、50mL离心管、5mL离心管、1.5mL离心管、0.9％氯化钠注射液，细胞超声波粉碎仪；
步骤：采用泡球蚴感染的昆明鼠颈部脱臼致死；75％乙醇浸泡15min体表消毒；按解剖层次开腹；剪取腹腔内生长良好的泡球蚴组织放入培养皿中加入0.9％氯化钠注射液6mL；用眼科剪小心去除泡球蚴表面的宿主组织和血管，将泡球蚴放入灭菌处理的研钵中；
用研钵杵破碎组织，经医用纱布过滤，去除囊壁和多余杂质；原头蚴过滤进50mL离心管中，加入0.9％氯化钠注射液25mL混匀，自然沉淀去除上清，反复5次，以洗去泡球蚴囊液、囊壁和杂质；取3mL原头蚴装入5mL离心管中，在冰浴条件下，放入超声波细胞破碎仪中600w，超声3s，间隔6s，共超声5min后见清亮液体；将超声破碎后的悬混液分装进1.5mL离心管内，3500rpm/min，4℃离心10min，收集上清，即为提取的蛋白；用BCA蛋白定量试剂盒测定所获上清蛋白浓度；
(2)免疫小鼠
材料：试验1所准备的原头蚴抗原、选择与所用骨髓瘤细胞同源的Balb/c健康雌性小鼠，鼠龄在6～8周；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂；
步骤：初次免疫：原头蚴抗原加等体积弗氏完全佐剂，乳化到滴水不扩散，做小鼠背部皮下多点注射，注射体积200μL/只小鼠，两周后进行第二次免疫；
第二次免疫：取原头蚴抗原加等体积弗氏不完全佐剂，乳化到滴水不扩散，做小鼠背部皮下多点注射，注射体积200μL/只小鼠，两周后进行第三次免疫；
第三次免疫：取原头蚴抗原加等体积弗氏不完全佐剂，乳化到滴水不扩散，做小鼠背部皮下多点注射，注射体积200μL/只小鼠；
加强免疫：采上述小鼠尾静脉血离心取血清测效价，效价达1:80000以上的小鼠融合前三天取原头蚴抗原加强免疫，腹腔注射体积200μL/只小鼠；
(3)饲养细胞的制备
材料：Balb/c小鼠1只、消毒备用的手术器械、超净工作台，RPMI-1640基础培养液、RPMI-1640完全培养液：RPMI-1640基础培养液40mL加入10mL胎牛血清、100×青霉素-链霉素、100×L-谷氨酰胺，50×HAT储备液、HAT选择培养液：完全培养液49mL加入1mL50倍HAT储备液；
步骤：融合前1d选择一只健康的Balb/c鼠安乐死，浸泡于75％的酒精中3min，随即放入生物安全柜中，腹部朝上固定于解剖板上；用眼科镊子提起小鼠腹部皮肤，用无菌眼科剪剪开腹部皮肤，经钝性剥离使腹膜充分暴露；用酒精棉球擦拭腹膜消毒，用5mL一次性注射器吸取RPMI-1640基础培养液，注入小鼠腹腔，注射器停留不动，反复抽吸几次，用原注射器吸出腹腔内液体，注入15mL离心管中；1000rpm离心5min，弃上清，加入适量HAT选择培养液重悬细胞并稀释1×105/mL，放入96孔细胞培养板中，100μL/孔，铺板5块板，放置在37℃，5％CO2培养箱中，24h内密切观察细胞生长情况；
(4)骨髓瘤细胞的准备
材料：骨髓瘤细胞SP2/0细胞，RPMI-1640基础培养液、100×青霉素-链霉素、100×L-谷氨酰胺、RPMI-1640完全培养液：RPMI-1640基础培养液40mL加入10mL胎牛血清，8-氮鸟嘌呤；
步骤：骨髓瘤细胞选取SP2/0细胞；融合前20～30d，进行SP2/0细胞的复苏；经过8-氮鸟嘌呤筛选，放入75cm2细胞培养瓶中扩大培养；试验时选取处于对数生长期的、形态良好的、活细胞计数超过95％的骨髓瘤细胞，将其完全吹下，转移到50mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，再用RPMI-1640洗涤2次；加RPMI-1640至20mL计数，取2×107个细胞待用；
(5)脾细胞制备
取加强免疫3d后的小鼠一只安乐死，浸泡于75％的酒精中3min，随即放入生物安全柜中取出脾脏，去除结缔组织；用RPMI-1640培养液冲洗一次，碾碎，过200目网筛，用10mLRPMI-1640培养液冲洗网筛，制成细胞悬液后转移到50mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清；加入4℃预冷的0.91％NH4Cl，混匀，冰浴静置5min；加入15mLRPMI-1640基础培养液终止NH4Cl作用，1000rpm，离心5min，弃上清，再用RPMI-1640基础培养液冲洗2次；用细胞计数器计数，取1×108个脾细胞，悬浮备用；
(6)细胞融合
材料：水浴锅、离心机、滤纸、50mL离心管、5～10mLtip头、1mL吸管、细胞计数器，细胞融合剂PEG1500、RPMI-1640基础培养液、RPMI-1640完全培养液、HAT培养液；
步骤：将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:5的比例混合在一起，在50mL离心管内用RPMI-1640培养液洗1次，1200rpm离心8min，弃上清；用灭菌滤纸吸净残留液体，轻轻弹击离心管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状；将离心管置于37℃水浴中，90s内加入预热的1mL50％PEG溶液，边加边轻晃离心管，静置1min；加预热的RPMI-1640基础培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1mL，2mL，3mL，4mL，5mL和10mL，边加边轻晃离心管；1000rpm离心10min，弃上清；加适量HAT培养液轻轻悬浮细胞；将融合后的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板中，100μL/孔，将培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
(7)细胞克隆的观察和换液
材料：倒置显微镜，RPMI-1640完全培养液，HT选择培养液：49mL完全培养液加入1mL50倍HT储备液；
步骤：细胞融合后第3d开始，对细胞进行仔细观察，记录好细胞的生长状态、培养液有无污染、饲养细胞的状况；第5开始更换培养液，采用半换液方式，每2～3天换一次HAT培养液，观察杂交瘤细胞是否出现；10d后，改用HT培养液，三次克隆后换RPMI-1640完全培养液；
(8)筛选分泌抗体的杂交瘤细胞
在培养后的第8天，按前述细胞克隆的观察结果对5块培养板上所有的有细胞克隆生长的细胞培养孔采用ELISA法检测杂交瘤细胞抗体产生的情况；
材料：1)磷酸盐缓冲液：8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾，蒸馏水加至800mL，用1MHCL调pH至7.2，加水到1000mL；2)封闭液5％脱脂奶粉：5g脱脂奶粉，蒸馏水加至80mL，充分溶解后，定容到100mL；3)洗涤缓冲液：0.5mL吐温20加入到1000mL1×PBS中；4)底物显色A液：1.46g磷酸氢二钠、0.933g柠檬酸、0.75％双氧水0.64mL、蒸馏水加至100mL；5)底物显色B液：TMB20mg溶于10mL无水乙醇后加90mL水；6)底物显色反应液：底物显色A液，底物显色B液1:1混合；7)终止液2MH2SO4取浓H2SO427.62mL，缓缓加入到473mL的蒸馏水中，混匀；8)抗原包被液0.1M碳酸盐缓冲液pH9.6：碳酸钠1.59g、碳酸氢钠2.93、蒸馏水加至1000mL；9)辣根过氧化物酶HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体；10)酶标仪设定波长为450nm；
步骤：1)抗原包被：用包被液稀释Em-PSC抗原至0.2μg/mL，96孔酶标板每孔加入100μL，4℃过夜，次日用PBST洗板3次，每次3min，拍干；2)封闭：用1×PBS配制5％的脱脂乳，每孔加入200μL封闭液，37℃孵育1h，PBST洗板3次，每次3min，拍干；3)加待测样品：无菌条件下取细胞培养板上生长成簇的杂交瘤细胞上清液加入到酶标板中，每孔加入100μL，SP2/0细胞上清液为阴性对照，37℃孵育1h，PBST洗板3次，每次3min，拍干；4)加二抗：将山羊抗小鼠HRP-IgG抗体稀释10000倍，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板5次，每次3min，拍干；5)显色：加入底物显色反应液，100μL/孔，避光37℃显色10～15min；6)终止：加入终止液，50μL/孔；7)读值：以450nm单波长测定各孔OD值；8)判定：以与阴性对照孔OD值的比值P/N大于2.1作为判断为阳性的临界点；选取阳性孔中高OD值孔，对其所对应的细胞培养孔进行细胞的克隆化；
(9)目标杂交瘤细胞的克隆化采用有限稀释法
亚克隆前1d制备饲养细胞，制备方法同试验3；将选定的强阳性单个细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：王冰洁，张壮志，赵莉，班万里，官亚婷，张玲，郭宝平，郭刚，段兰利，刘志强，喻昌盛，汪保，俞进，邱国斌，卡那提拜克·开比热，乌云花，布于努尔其其格，
申请(专利权)人：新疆畜牧科学院兽医研究所新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心，
类型：发明
国别省市：新疆;65