一种抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的制备方法及其应用，属于生物技术及细胞工程领域。本发明专利技术通过杂交瘤技术采用Balb/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合建立杂交瘤细胞株。由上述细胞通过体外培养法、动物体内诱生腹水法制备单克隆抗体；制备了细粒棘球绦虫成虫免疫荧光试剂盒。本发明专利技术为临床和科研机构提供了抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的特异性单克隆抗体，它既可用于ELISA试验对临床样品进行检测，也可用于免疫组化试验对病理标本进行临床诊断，还可为包虫病研究部门提供便利的研究工具，在终末宿主感染细粒棘球绦虫的诊断、检测中有广泛的应用价值，为包虫病的基线调查和防控效果评估提供了技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的制备方法及其应用
本专利技术属于生物及细胞工程
，涉及一种抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的制备方法及其应用。
技术介绍
包虫病(棘球蚴病)，是由细粒棘球绦虫(E.granulosus)的中绦期幼虫寄生在哺乳动物脏器内引起的疾病，是一种严重的人畜共患寄生虫病。包虫病呈世界性分布，遍及五大洲，在中东、南欧、拉丁美洲、中亚、澳大利亚和非洲部分国家流行。在我国，有21个省市自治区均发现此病，发病面积占全国总面积的86.9％，其中新疆﹑甘肃﹑宁夏、青海﹑西藏﹑四川﹑内蒙古等省(自治区)流行最为严重，受威胁人口约6600万。由细粒棘球绦虫幼虫引起囊型包虫病，是我国人畜间的主要患病类型，引起人包虫病的发病率较高，占包虫病的95％。细粒棘球绦虫成虫在终末宿主犬、狼、狐狸等食肉动物体内生长约6个月，发育成熟后，其含卵的孕卵节片随粪便排出，随后每7～14d虫卵成熟、孕节脱落一次；中间宿主因摄入虫卵受到感染而发病。因此，细粒棘球绦虫成虫虫卵是包虫病发病的根源，终末宿主犬(犬科动物)是包虫病传播过程中最重要的传染源。了解和掌握家/牧犬感染细粒棘球绦虫的状况，是包虫病流行病学调查和防控措施实施后判定干预效果考核的重要指标。因此，我们开展细粒棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的研究，对包虫病终末宿主的诊断试剂盒的研制奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的制备方法及其应用。1、本专利技术的目的是提供能分泌抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2、本专利技术的另一目的是提供由上述细胞株分泌的抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的特异性单克隆抗体。3、本专利技术的另一目的是上述单克隆抗体在终末宿主感染细粒棘球绦虫成虫诊断和检测上的可能应用。其技术方案如下：一种抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：步骤1、建立细胞株(1)抗原制备材料：新鲜感染包囊的病肝，10～12月龄、体重8～10公斤的健康Beagle犬(由常州贝乐实验动物养殖有限公司提供)，50mL离心管、1.5mL离心管、磷酸盐缓冲液(PBS：8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾，蒸馏水加至800mL，用1MHCL调pH至7.2，加水到1000mL)，1％TritonX-100(PBS配置)，台式离心机(Eppendorf)。步骤：将新鲜感染包囊的病肝带回实验室，用水冲洗脏器表面，用75％酒精进行表面消毒，在无菌条件下切开外囊，吸取囊液后，将内囊完整摘除并置于含有双抗的PBS缓冲液中反复冲洗，切开内囊并收集原头蚴，计数，取2.5万枚原头蚴经口服人工感染犬，45天后，剖检犬，收集细粒棘球绦虫成虫。取2mL成虫装入5mL离心管中，加入等体积的1％TritonX-100，轻轻摇晃7～10次，将悬混液分装进1.5mL离心管内，3500rpm/min，4℃离心10min，收集上清，即为提取的细粒棘球绦虫成虫表膜抗原(EgSfAg)。用BCA蛋白定量试剂盒(Thermo公司)测定所获上清蛋白浓度。(2)免疫小鼠材料：试验1所准备的细粒棘球绦虫成虫表膜抗原、选择与所用骨髓瘤细胞同源的Balb/c健康雌性小鼠(购自新疆实验动物中心)，鼠龄在6～8周。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂(Sigma公司)。步骤：初次免疫：细粒棘球绦虫成虫表膜抗原加等体积弗氏完全佐剂，乳化到滴水不扩散即可，做小鼠背部皮下多点注射，注射体积200μL(100μg抗原)/只小鼠，两周后进行第二次免疫。第二次免疫：取细粒棘球绦虫成虫表膜抗原加等体积弗氏不完全佐剂，乳化到滴水不扩散即可，做小鼠背部皮下多点注射，注射体积200μL(50μg抗原)/只小鼠，两周后进行第三次免疫。第三次免疫：取细粒棘球绦虫成虫表膜抗原加等体积弗氏不完全佐剂，乳化到滴水不扩散即可，做小鼠背部皮下多点注射，注射体积200μL(50μg抗原)/只小鼠。加强免疫：采上述小鼠尾静脉血离心取血清测效价(用ELISA方法检测)，效价达1:80000以上的小鼠融合前三天取细粒棘球绦虫成虫表膜抗原加强免疫，腹腔注射体积200μL(100μg抗原)/只小鼠。(3)饲养细胞的制备材料：Balb/c小鼠1只、消毒备用的手术器械、超净工作台、DMEM基础培养液、DMEM完全培养液：DMEM基础培养液40mL加入10mL胎牛血清、100×青霉素-链霉素、100×L-谷氨酰胺(Hyclone公司)，50×HAT储备液、HAT选择培养液：完全培养液49mL加入1mL50倍HAT储备液(Sigma公司)。步骤：融合前1d选择一只健康的Balb/c鼠安乐死，浸泡于75％的酒精中3min，随即放入生物安全柜中，腹部朝上固定于解剖板上。用眼科镊子提起小鼠腹部皮肤，用无菌眼科剪剪开腹部皮肤，经钝性剥离使腹膜充分暴露。用酒精棉球擦拭腹膜消毒，用5mL一次性注射器吸取DMEM基础培养液，注入小鼠腹腔，注射器停留不动，反复抽吸几次，用原注射器吸出腹腔内液体，注入15mL离心管中。1000rpm离心5min，弃上清，加入适量HAT选择培养液重悬细胞并稀释1×105/mL，放入96孔细胞培养板中，100μL/孔，铺板5块板，放置在37℃，5％CO2培养箱中，24h内密切观察细胞生长情况。(4)骨髓瘤细胞的准备材料：骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)，DMEM基础培养液、DMEM完全培养液：DMEM基础培养液40mL加入10mL胎牛血清、100×青霉素-链霉素、100×L-谷氨酰胺(Hyclone公司)，8-氮鸟嘌呤(Sigma公司)。步骤：骨髓瘤细胞选取SP2/0细胞(本实验室液氮冻存)。融合前20～30d，进行SP2/0细胞的复苏。经过8-氮鸟嘌呤(Sigma公司)筛选，放入75cm2细胞培养瓶中扩大培养。试验时选取处于对数生长期的、形态良好的、活细胞计数超过95％的骨髓瘤细胞，将其完全吹下，转移到50mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，再用DMEM洗涤2次。加DMEM至20mL计数，取2×107个细胞待用。(5)脾细胞制备取加强免疫3d后的小鼠一只安乐死，浸泡于75％的酒精中3min，随即放入生物安全柜中取出脾脏，去除结缔组织。用DMEM培养液冲洗一次，碾碎，过200目网筛，用10mLDMEM培养液冲洗网筛，制成细胞悬液后转移到50mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清。加入4℃预冷的0.91％NH4Cl，混匀，冰浴静置5min。加入15mLDMEM基础培养液终止NH4Cl作用，1000rpm，离心5min，弃上清，再用DMEM基础培养液冲洗2次。用细胞计数器计数，取1×108个脾细胞，悬浮备用。(6)细胞融合材料：水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)、离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、滤纸、50mL离心管、5～10mLtip头、1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1、建立细胞株/n(1)抗原制备/n材料：新鲜感染包囊的病肝，10～12月龄、体重8～10公斤的健康Beagle犬由常州贝乐实验动物养殖有限公司提供，50mL离心管、1.5mL离心管、磷酸盐缓冲液：8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾，蒸馏水加至800mL，用1M HCL调pH至7.2，加水到1000mL，1％Triton X-100用PBS配置，Eppendorf台式离心机；/n步骤：将新鲜感染包囊的病肝带回实验室，用水冲洗脏器表面，用75％酒精进行表面消毒，在无菌条件下切开外囊，吸取囊液后，将内囊完整摘除并置于含有双抗的PBS缓冲液中反复冲洗，切开内囊并收集原头蚴，计数，取2.5万枚原头蚴经口服人工感染犬，45天后，剖检犬，收集细粒棘球绦虫成虫；取2mL成虫装入5mL离心管中，加入等体积的1％Triton X-100，轻轻摇晃7～10次，将悬混液分装进1.5mL离心管内，3500rpm/min，4℃离心10min，收集上清，即为提取的细粒棘球绦虫成虫表膜抗原；用Thermo公司BCA蛋白定量试剂盒测定所获上清蛋白浓度；/n(2)免疫小鼠/n材料：试验1所准备的细粒棘球绦虫成虫表膜抗原、选择与所用骨髓瘤细胞同源的Balb/c健康雌性小鼠购自新疆实验动物中心，鼠龄在6～8周；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；/n步骤：初次免疫：细粒棘球绦虫成虫表膜抗原加等体积弗氏完全佐剂，乳化到滴水不扩散，做小鼠背部皮下多点注射，100μg抗原注射体积200μL/只小鼠，两周后进行第二次免疫；/n第二次免疫：取细粒棘球绦虫成虫表膜抗原加等体积弗氏不完全佐剂，乳化到滴水不扩散，做小鼠背部皮下多点注射，50μg抗原注射体积200μL/只小鼠，两周后进行第三次免疫；/n第三次免疫：取细粒棘球绦虫成虫表膜抗原加等体积弗氏不完全佐剂，乳化到滴水不扩散，做小鼠背部皮下多点注射，50μg抗原注射体积200μL/只小鼠；/n加强免疫：采上述小鼠尾静脉血离心取血清测效价用ELISA方法检测，效价达1∶80000以上的小鼠融合前三天取细粒棘球绦虫成虫表膜抗原加强免疫，100μg抗原腹腔注射体积200μL/只小鼠；/n(3)饲养细胞的制备/n材料：Balb/c小鼠1只、消毒备用的手术器械、超净工作台、DMEM基础培养液、DMEM完全培养液：DMEM基础培养液40mL加入10mL胎牛血清、100×青霉素-链霉素、Hyclone公司100×L-谷氨酰胺，50×HAT储备液、Sigma公司HAT选择培养液：完全培养液49mL加入1mL50倍HAT储备液；/n步骤：融合前1d选择一只健康的Balb/c鼠安乐死，浸泡于75％的酒精中3min，随即放入生物安全柜中，腹部朝上固定于解剖板上；用眼科镊子提起小鼠腹部皮肤，用无菌眼科剪剪开腹部皮肤，经钝性剥离使腹膜充分暴露；用酒精棉球擦拭腹膜消毒，用5mL一次性注射器吸取DMEM基础培养液，注入小鼠腹腔，注射器停留不动，反复抽吸几次，用原注射器吸出腹腔内液体，注入15mL离心管中；1000rpm离心5min，弃上清，加入适量HAT选择培养液重悬细胞并稀释1×10...

【技术特征摘要】
1.一种抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、建立细胞株
(1)抗原制备
材料：新鲜感染包囊的病肝，10～12月龄、体重8～10公斤的健康Beagle犬由常州贝乐实验动物养殖有限公司提供，50mL离心管、1.5mL离心管、磷酸盐缓冲液：8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾，蒸馏水加至800mL，用1MHCL调pH至7.2，加水到1000mL，1％TritonX-100用PBS配置，Eppendorf台式离心机；
步骤：将新鲜感染包囊的病肝带回实验室，用水冲洗脏器表面，用75％酒精进行表面消毒，在无菌条件下切开外囊，吸取囊液后，将内囊完整摘除并置于含有双抗的PBS缓冲液中反复冲洗，切开内囊并收集原头蚴，计数，取2.5万枚原头蚴经口服人工感染犬，45天后，剖检犬，收集细粒棘球绦虫成虫；取2mL成虫装入5mL离心管中，加入等体积的1％TritonX-100，轻轻摇晃7～10次，将悬混液分装进1.5mL离心管内，3500rpm/min，4℃离心10min，收集上清，即为提取的细粒棘球绦虫成虫表膜抗原；用Thermo公司BCA蛋白定量试剂盒测定所获上清蛋白浓度；
(2)免疫小鼠
材料：试验1所准备的细粒棘球绦虫成虫表膜抗原、选择与所用骨髓瘤细胞同源的Balb/c健康雌性小鼠购自新疆实验动物中心，鼠龄在6～8周；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；
步骤：初次免疫：细粒棘球绦虫成虫表膜抗原加等体积弗氏完全佐剂，乳化到滴水不扩散，做小鼠背部皮下多点注射，100μg抗原注射体积200μL/只小鼠，两周后进行第二次免疫；
第二次免疫：取细粒棘球绦虫成虫表膜抗原加等体积弗氏不完全佐剂，乳化到滴水不扩散，做小鼠背部皮下多点注射，50μg抗原注射体积200μL/只小鼠，两周后进行第三次免疫；
第三次免疫：取细粒棘球绦虫成虫表膜抗原加等体积弗氏不完全佐剂，乳化到滴水不扩散，做小鼠背部皮下多点注射，50μg抗原注射体积200μL/只小鼠；
加强免疫：采上述小鼠尾静脉血离心取血清测效价用ELISA方法检测，效价达1∶80000以上的小鼠融合前三天取细粒棘球绦虫成虫表膜抗原加强免疫，100μg抗原腹腔注射体积200μL/只小鼠；
(3)饲养细胞的制备
材料：Balb/c小鼠1只、消毒备用的手术器械、超净工作台、DMEM基础培养液、DMEM完全培养液：DMEM基础培养液40mL加入10mL胎牛血清、100×青霉素-链霉素、Hyclone公司100×L-谷氨酰胺，50×HAT储备液、Sigma公司HAT选择培养液：完全培养液49mL加入1mL50倍HAT储备液；
步骤：融合前1d选择一只健康的Balb/c鼠安乐死，浸泡于75％的酒精中3min，随即放入生物安全柜中，腹部朝上固定于解剖板上；用眼科镊子提起小鼠腹部皮肤，用无菌眼科剪剪开腹部皮肤，经钝性剥离使腹膜充分暴露；用酒精棉球擦拭腹膜消毒，用5mL一次性注射器吸取DMEM基础培养液，注入小鼠腹腔，注射器停留不动，反复抽吸几次，用原注射器吸出腹腔内液体，注入15mL离心管中；1000rpm离心5min，弃上清，加入适量HAT选择培养液重悬细胞并稀释1×105/mL，放入96孔细胞培养板中，100μL/孔，铺板5块板，放置在37℃，5％CO2培养箱中，24h内密切观察细胞生长情况；
(4)骨髓瘤细胞的准备
材料：骨髓瘤细胞-SP2/0细胞，DMEM基础培养液、DMEM完全培养液：DMEM基础培养液40mL加入10mL胎牛血清、100×青霉素-链霉素、Hyclone公司100×L-谷氨酰胺，Sigma公司8-氮鸟嘌呤；
步骤：本实验室液氮冻存的骨髓瘤细胞选取SP2/0细胞；融合前20～30d，进行SP2/0细胞的复苏；经过8-氮鸟嘌呤筛选，放入75cm2细胞培养瓶中扩大培养；试验时选取处于对数生长期的、形态良好的、活细胞计数超过95％的骨髓瘤细胞，将其完全吹下，转移到50mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，再用DMEM洗涤2次；加DMEM至20mL计数，取2×107个细胞待用；
(5)脾细胞制备
取加强免疫3d后的小鼠一只安乐死，浸泡于75％的酒精中3min，随即放入生物安全柜中取出脾脏，去除结缔组织；用DMEM培养液冲洗一次，碾碎，过200目网筛，用10mLDMEM培养液冲洗网筛，制成细胞悬液后转移到50mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清；加入4℃预冷的0.91％NH4Cl，混匀，冰浴静置5min；加入15mLDMEM基础培养液终止NH4Cl作用，1000rpm，离心5min，弃上清，再用DMEM基础培养液冲洗2次；用细胞计数器计数，取1×108个脾细胞，悬浮备用；
(6)细胞融合
材料：水浴锅、离心机、滤纸、50mL离心管、5～10mLtip头、1mL吸管、细胞计数器；细胞融合剂PEG1500、DMEM基础培养液、DMEM完全培养液、HAT培养液；
步骤：将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶5的比例混合在一起，在50mL离心管内用DMEM培养液洗1次，1200rpm离心8min，弃上清；用灭菌滤纸吸净残留液体，轻轻弹击离心管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状；将离心管置于37℃水浴中，90s内加入预热的1mL50％PEG溶液，边加边轻晃离心管，静置1min；加预热的DMEM基础培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1mL，2mL，3mL，4mL，5mL和10mL，边加边轻晃离心管；1000rpm离心10min，弃上清；加适量HAT培养液轻轻悬浮细胞；将融合后的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板中，100μL/孔，将培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
(7)细胞克隆的观察和换液
材料：倒置显微镜，DMEM完全培养液，HT选择培养液：49mL完全培养液加入1mL50×HT储备液；
步骤：细胞融合后第3d开始，对细胞进行仔细观察，记录好细胞的生长状态、培养液有无污染、饲养细胞的状况；第5开始更换培养液，采用半换液方式，每2～3天换一次HAT培养液，观察杂交瘤细胞是否出现；10d后，改用HT培养液，三次克隆后换DMEM完全培养液；
(8)筛选分泌抗体的杂交瘤细胞
在培养后的第8天，按前述细胞克隆的观察结果对5块培养板上所有的有细胞克隆生长的细胞培养孔采用ELISA法检测杂交瘤细胞抗体产生的情况；
材料：1)磷酸盐缓冲液PBS：8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾，蒸馏水加至800mL，用1MHCL调pH至7.2，加水到1000mL；2)封闭液：5g脱脂奶粉，蒸馏水加至80mL，充分溶解后，定容到100mL；3)洗涤缓冲液：0.5mL吐温20加入到1000mL1×PBS中；4)底物显色A液：1.46g磷酸氢二钠、0.933g柠檬酸、0.75％双氧水0.64mL、蒸馏水加至100mL；5)底物显色B液：TMB20mg溶于10mL无水乙醇后加90mL水；6)底物显色反应液：底物显色A液，底物显色B液1∶1混合；7)终止液2MH2SO4取浓H2SO427.62mL，缓缓加入到473mL的蒸馏水中，混匀；8)抗原包被液pH9.6：碳酸钠1.59g、碳酸氢钠2.93、蒸馏水加至1000mL；9)辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体；10)酶标仪设定波长为450nm；
步骤：1)抗原包被：用包被液稀释EgSfAg至4μg/mL，96孔酶标板每孔加入100μL，4℃过夜，次日用PBST洗板3次，每次1min，拍干；2)封闭：用1×PBS配制5％的脱脂乳，每孔加入200μL封闭液，37℃孵育1h，PBST洗板3次，每次1min，拍干；3)加待测样品：无菌条件下取细胞培养板上生长成簇的杂交瘤细胞上清液加入到酶标板中，每孔加入100μL，SP2/0细胞上清液为阴性对照，37℃孵育1h，PBST洗板3次，每次1min，拍干；4)加二抗：将山羊抗小鼠HRP-IgG抗体稀释8000倍，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板5次，每次1min，拍干；5)显色：加入底物显色反应液，100μL/孔，避光37℃显色10～15min；6)终止：加入终止液，50μL/孔；7)读值：以450nm单波长测定各孔OD值；8)判定：以与阴性对照孔OD值的P/N值大于2.1作为判断为阳性的临界点；选取阳性孔中高OD值孔，对其所对应的细胞培养孔进行细胞的克隆化；
(9)阳性杂交瘤细胞的克隆化
...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵莉，张壮志，班万里，王冰洁，张玲，官亚婷，张旭，石保新，郭宝平，闫昊，吕凤军，张迎忠，丁伟强，王杰，陆桂丽，汪保，阿依江·卡那提拜克，
申请(专利权)人：新疆畜牧科学院兽医研究所新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心，
类型：发明
国别省市：新疆;65