一种香菇TW1151菌株的InDel标记指纹图谱及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种香菇TW1151菌种的InDel标记指纹图谱及其构建方法，该指纹图谱由7对基于香菇全基因组测序后开发的InDel标记组成。本发明专利技术的香菇TW1151菌种的InDel标记指纹图谱可用于香菇TW1151菌种的特异性鉴定，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的44个香菇菌种中具有香菇TW1151菌种的专一性。44个香菇菌种中具有香菇TW1151菌种的专一性。44个香菇菌种中具有香菇TW1151菌种的专一性。

【技术实现步骤摘要】
一种香菇TW1151菌株的InDel标记指纹图谱及其构建方法


[0001]本专利技术属于香菇菌种的检测领域，具体涉及一种香菇TW1151菌种的InDel标记指纹图谱及其构建方法。

技术介绍

[0002]香菇(Lentinula edodes(Berk.)Pegler)因具有较高的营养价值和药用价值，而备受消费者欢迎。中国是世界上最早进行香菇人工栽培的国家，栽培历史已有800多年，目前香菇是国内栽培最广、产量最高的菇种。据中国食用菌协会统计，2018年中国食用菌总产量为3842.04万吨，其中香菇总产量为1043.12万吨，占国内食用菌总产量的27.15％，占世界香菇总产量的90％以上。近年来香菇产业成为国内精准扶贫的重要抓手，据统计全国超过50％以上的国家级贫困县选择香菇作为重要产业，我国香菇栽培规模进一步扩大，但随着我国香菇产业的快速发展，香菇生产用种“同种异名，异种同名”的问题日益突出，这不仅损害了香菇育种者的知识产权更为生产者造成了极大地风险，为香菇产业进一步发展造成了隐患。为保障育种者的权益和降低生产者的风险，促进我国香菇产业健康、稳定和可持续发展，建立一种简便、快速、可靠的香菇菌种特异性鉴定技术迫在眉睫。
[0003]随着生物信息学的快速发展，DNA测序技术的不断成熟，测序的通量在不断增加而成本在降低。DNA分子标记技术能够从基因水平上检测香菇菌种的遗传特异性，香菇全基因组测序的完成为InDel标记的开发提供了便利。InDel分子标记是一种基于高通量测序技术的应用，降低了InDel标记开发的成本，适用于香菇全基因组测序分子标记的开发。且InDel标记具有数量丰富、准确性高、稳定性好、快捷简便等优点，不仅用于分子标记辅助育种，而且也可用于香菇菌株鉴定。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种香菇TW1151菌种的InDel标记指纹图谱及其构建方法与应用，该指纹图谱与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。
[0005]本专利技术的一种香菇TW1151菌种的InDel标记指纹图谱，该指纹图谱由7对InDel标记组成，是基于香菇基因组插入/缺失片段开发的InDel标记引物，扩增带型好，重复性高，标记详细信息如表1。
[0006]表1 InDel标记引物信息列表
[0007][0008]本专利技术还提供了一种香菇TW1151菌种的InDel标记指纹图谱的应用，是利用香菇基因组插入/缺失片段开发的7对InDel标记引物，对香菇菌种进行InDel标记扩增，将得到的带型与TW1151菌种的带型对照，与该带型一致即为香菇TW1151菌种；
[0009]其中香菇TW1151菌种的带型编号组合为：12(1+2)1(1+2)(1+2)(1+2)。
[0010]通过对收集的44个香菇品种的InDel标记引物带型扩增，本专利技术确定了7对InDel标记引物在44个香菇品种中扩增出的等位片段的数量并编号(表2)，通过不同InDel等位位点的编号组合可有效识别TW1151菌种(图2
‑
8)。通过DNA分子量对照D2000bp DNA ladder可确定各InDel标记引物扩增的等位位点的相对分子量，存在TW1151菌种特异InDel等位片段组合的菌种，即是香菇TW1151菌种，该菌种的编号组合为：12(1+2)1(1+2)(1+2)(1+2)。
[0011]表2 InDel引物扩增的等位片段信息汇总表
[0012][0013][0014]本专利技术还提供了上述香菇TW1151菌种的InDel标记指纹图谱的构建方法，该方法包括如下步骤：
[0015](1)菌丝培养：将香菇菌丝转接到马铃薯葡萄糖培养基PDA中，23～25℃下避光培养，10d后收集菌丝；
[0016](2)基因组DNA的提取：用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度为20～30ng/uL；
[0017]CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：
[0018]①
取冷冻干燥后的香菇菌丝于2mL离心管中，并放入2
‑
3颗钢珠；
[0019]②
将离心管放入多样品组织研磨机中，设置频率60Hz，时间30s研磨至均匀粉末；
[0020]③
加入65℃预热1h的2
×
CTAB抽提液，于65℃保温60min，间隔20min轻摇混匀一次；
[0021]④
12000rpm、4℃离心20min，分装上清液，分装两管各800uL；
[0022]⑤
在上述上清液中加入体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；
[0023]⑥
在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液(记录体积)移入另一离心管中；
[0024]⑦
在上述离心管中加入相对于步骤
⑥
中的上清液2/3体积的
‑
20℃预冷的异丙醇，混匀，
‑
20℃下静置沉淀1h，之后8000rpm、4℃离心10min，弃上清；
[0025]⑧
将得到的沉淀加入1mL浓度为70％乙醇洗涤1次，8000rpm，室温离心5min；
[0026]⑨
弃乙醇，超净工作台中吹干；加入100μL 10
×
TE缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解，加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；
[0027]⑩
将得到的DNA提取物于
‑
20℃冰箱贮藏备用；
[0028]InDel分子标记的检测：对上述提取的DNA进行全基因组InDel标记的PCR扩增；PCR
扩增体系为：总体积20μL，包括：Premix Taq
TM
(1.25U/25μL Taq DNA酶，0.4mM/L dNTP，0.3mM/L PCR buffer)10μL，10μmol/L InDel标记正向引物和反向引物总体积各1μL，浓度20～30ng/μL提取的模板DNA 2μL，ddH2O 6μL；
[0029]PCR反应条件：94℃5min；94℃45second，55
‑
60℃45second，72℃30second，35个循环；72℃7min；10℃保存；
[0030]电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物，点样7μL于加入核酸染料的琼脂糖凝胶上电泳，琼脂糖凝胶的体积百分比浓度为2.5％，电泳缓冲液为1
×
TAE，电压90v，电流300mA，功率100W，电泳5h，拍照，分析结果；
[0031]采用7对InDel标记引物对香菇菌株进行PCR扩增，通本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种香菇TW1151菌种的InDel标记指纹图谱的构建方法，包括：(1)菌丝培养：将香菇菌丝转接到PDA平板上，25℃下避光培养，10d后收集菌丝；(2)基因组DNA的提取：用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度为20～30ng/uL；CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：
①
取冷冻干燥后的香菇菌丝于2mL离心管中，并放入2
‑
3颗钢珠；
②
将离心管放入多样品组织研磨机中，设置频率60Hz，时间30s研磨至均匀粉末；
③
加入65℃预热1h的2
×
CTAB抽提液，于65℃保温60min，间隔20min轻摇混匀一次；
④
12000rpm、4℃离心20min，分装上清液，分装为两管各800μL；
⑤
在上述上清液中加入体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；
⑥
在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；
⑦
在上述离心管中加入相对于步骤
⑥
中上清液2/3体积的
‑
20℃预冷的异丙醇，混匀，
‑
20℃下静置沉淀1h，之后8000rpm、4℃离心10min，弃上清；
⑧
将得到的沉淀加入1mL浓度为70％乙醇洗涤1次，8000rpm，室温离心5min；
⑨
弃乙醇，超净工作台中吹干；加入100μL 10
×
TE缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解，加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；
⑩
将得到的DNA提取物于
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20℃冰箱贮藏备用；(3)InDel分子标记的检测：对上述提取的DNA进行开发的InDel标记的PCR扩增；PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：Premix Taq
TM
(1.25U/25μL Taq DNA酶，0.4mM/L dNTP，0.3mM/L PCR buffer)10uL，10μmol/L InDel标记正向引物和反向引物总体积各1μL，浓度20～30ng/μL提取的模板DNA 2μL、ddH2O 6μL；PCR反应条件：94℃5min；94℃45second，55
‑
60℃45second，72℃30second，35个循环；72℃7min；10℃保存；(4)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物点样7μL于加入核酸染料的琼脂糖凝胶上进行电泳，琼脂糖凝胶的体积百分比浓度为2.5％，电泳缓冲液为1
×
TAE，电压90v，电流300mA...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丹，于海龙，章炉军，沈秀芬，谭琦，尚晓冬，宋春艳，张美彦，李巧珍，李玉，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：