一种血清/血浆蛋白质组分析新方法技术

本发明专利技术公开了一种血清/血浆蛋白质组分析新方法。本发明专利技术采用不同基团修饰的混合纳米颗粒可有效吸附不同种类的血清/血浆蛋白，实现血清/血浆中低丰度蛋白的选择性富集，有效避免了质谱鉴定时血清/血浆中高丰度蛋白对低丰度蛋白鉴定的干扰，结合反相C

【技术实现步骤摘要】
一种血清/血浆蛋白质组分析新方法


[0001]本专利技术涉及一种血清/血浆蛋白质组分析新方法，属于蛋白质组分析领域。

技术介绍

[0002]血清/血浆是唯一可以在身体各器官间内自由流动的液体，血清/血浆中不仅包括维持血清/血浆自身功能的蛋白，还含有全身其它组织器官释放的蛋白，目前推测血清/血浆中包含的蛋白种类已经超过10000余种，血清/血浆中蛋白的种类及丰度变化蕴藏着巨大的临床生理或病理信息，因此血清/血浆已经成为临床生物标志物研究的主要研究对象。国际人类血浆蛋白质组计划(Human Plasma Proteome Project，HUPO HPPP)的发起，就是要实现人类血浆蛋白成分的全面分析，确定不同人种间血浆蛋白组的差异或不同病理与生理状态的个体差异。目前基于液相色谱
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质谱技术的血清/血浆蛋白质组学研究飞速发展，可以实现一次性对几百种血浆/血清蛋白的同时定性/定量分析，然而血浆/血清蛋白具有丰度差异大、动态范围宽等特点，血浆中含量最高的18种蛋白总含量达到了血浆总蛋白含量的97％～99％，因此给血浆/血清蛋白的分离、检测带来了巨大的挑战。不去除高丰度蛋白的情况下，目前的质谱技术仅能达到300个左右血浆protein groups的鉴定规模，去除血浆/血清高丰度蛋白后可检测400～700个左右血浆protein groups，检测到其中大部分是血清/血浆功能相关的蛋白，这些蛋白能否真实代表疾病状态，还有待研究。基于液相色谱
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质谱方法的血浆/血清蛋白分析前，需要高丰度蛋白的去除或多级分离来增加低丰度蛋白的鉴定规模，目前的血浆/血清高丰度蛋白去除方法包括：有机溶剂沉淀、免疫亲和、多级色谱分离等，目前使用最多的还是基于免疫亲和的高丰度蛋白去除技术，如：染料亲和层析法是利用辛巴蓝或其它修饰形式的染料作为配基，亲和捕获血浆/血清中高丰度的清蛋白。免疫亲和层析是利用免疫球蛋白作为配基，与血浆/血清中的目标高丰度蛋白结合而将其去除。然而作为临床诊疗生物标志物的筛选来源，血清/血浆样本是否需要去除高丰度，目前仍是争议不断。尽管高丰度蛋白的高效去除可以提高质谱检测的蛋白鉴定深度，但去除操作时与高丰度蛋白相互结合/相互作用的蛋白也会随之损失，因此处理后的样品无法代表血液蛋白真实的生理状态，同时复杂的操作步骤也会引入额外人为误差。因此，血浆/血清样品不去除高丰度蛋白是最理想的选择。然而，不去除高丰度蛋白的情况下，目前的质谱技术所鉴定的血清/血浆蛋白数有限，目前所发现的23％的生物标志物主要集中在这300个高丰度蛋白中。如果需要筛选更多与疾病直接相关，而非血清/血浆活动相关的蛋白，则需要发展更好的血清/血浆蛋白制备及检测方法，实现对血清/血浆蛋白质组样品的定性及定量深度覆盖研究。

技术实现思路

[0003]本专利技术针对目前血清/血浆蛋白质组样品制备方法的局限性，系统优化了基于不同表面基团修饰的纳米颗粒对血清/血浆蛋白的选择性吸附能力，实现了不采用商业化产品去除高丰度血清/血浆蛋白的情况下，结合质谱数据非依赖型采集模式，实现了对血清/
血浆蛋白质组的定性与定量深度覆盖研究。
[0004]本专利技术所提供的血清/血浆蛋白质组样品的制备方法，包括如下步骤：
[0005]S1、将血清/血浆样品进行低温低速离心，去除细胞碎片等沉淀，保留上清液；
[0006]S2、向所述上清液中加入表面基团修饰的纳米颗粒，得到混悬液；
[0007]所述表面基团修饰的纳米颗粒为表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒、表面氨基修饰的SiO2纳米颗粒、表面兼性离子修饰的SiO2和TiO2纳米颗粒的混合物；
[0008]S3、将所述混悬液进行高速离心，去除上清液，保留沉淀Ⅰ；
[0009]S4、采用清洗缓冲液重悬所述沉淀Ⅰ重悬得到重悬液，将所述重悬液高速离心后去除上清，保留沉淀Ⅱ；
[0010]S5、采用消化缓冲液重新溶解所述沉淀Ⅱ，然后加入测序级的胰蛋白酶，经酶解即得血清/血浆蛋白质组样品；
[0011]所述消化缓冲液中包含能打开二硫键的还原剂以及烷基化巯基的烷基化试剂物。
[0012]上述的制备方法中，步骤S1中，所述血清/血浆样品的用量为100μl～10000μl；
[0013]所述低温低速离心的条件如下：
[0014]离心力为800～1500RCF，温度为2～8℃，时间为5～20分钟。
[0015]上述的制备方法中，步骤S2中，各种表面基团修饰的纳米颗粒可根据现有方法进行制备，也可根据下述方法进行制备：
[0016]请确认下述制备过程：
[0017]可按照stober法制备表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒，可按照下述步骤进行：将正硅酸乙酯(TEOS)乙醇溶液迅速加入到氨水、乙醇和水的混合溶液中，搅拌后密封条件下室温反应，将得到的混悬液离心收集生成的SiO2，采用乙醇洗涤后真空干燥所得白色粉末即为表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒；具体地，可将9mL28％的氨水、16.25mL乙醇、24.75mL去离子水混合；将体系分数为9％的正硅酸乙酯(TEOS)乙醇溶液50ml迅速加入到上述混合液中，搅拌1分钟，将搅拌速度降低至300rpm后用胶塞封口，室温下继续反应2小时，将生成的混悬液取出后2000RCF离心。
[0018]可按照下述方法制备表面氨基修饰的SiO2纳米颗粒：将表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒加入到硅烷偶联剂的乙醇溶液中进行反应即得；具体地，所述硅烷偶联剂可为3
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氨基丙基三乙氧基硅烷(((3
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Aminopropyl)triethoxysilane，APTES)，所述硅烷偶联剂的用量可为1mL/50mg表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒；可在室温下反应24h；反应结束后，可采用无水乙醇反复离心洗涤SiO2颗粒以除去未反应的硅烷偶联剂，并进行真空干燥。
[0019]可按照下述方法制备TiO2纳米颗粒：将四氯化钛(TiCl4)水溶液缓慢滴加至氨水溶液中，至体系pH值为8.0，反应结束后收集白色沉淀；将白色沉淀分散于无水乙醇中，置于聚四氟乙烯内衬不锈钢高压反应釜中进行反应即得；具体地，所述将四氯化钛(TiCl4)水溶液的摩尔浓度为0.2mol/L，氨水溶液的浓度为0.5mol/L，滴加过程中保持磁力搅拌；将所述聚四氟乙烯内衬不锈钢高压反应釜放置在鼓风干燥箱中150℃反应10小时；可将所得产物过325目筛。
[0020]可按照下述方法制备表面兼性离子修饰的SiO2纳米颗粒：表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒与2
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溴
‑2‑
甲基
‑
N
‑
(3
‑
(三乙氧基甲硅烷基)丙基)丙酰胺(SI
‑
ATRP引发剂)反应(可于37℃反应12h)后，加入SI
‑
ATRP聚合反应液，经反应(密闭反应4小时)即得；具体地，所述
SI
‑
ATRP聚合反应液的配比如下：N本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血清/血浆蛋白质组样品的制备方法，包括如下步骤：S1、将血清/血浆样品进行低温低速离心，去除沉淀，保留上清液；S2、向所述上清液中加入表面基团修饰的纳米颗粒，得到混悬液；所述表面基团修饰的纳米颗粒为表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒、表面氨基修饰的SiO2纳米颗粒、表面兼性离子修饰的SiO2和TiO2纳米颗粒的混合物；S3、将所述混悬液进行高速离心，去除上清液，保留沉淀Ⅰ；S4、采用清洗缓冲液重悬所述沉淀Ⅰ重悬得到重悬液，将所述重悬液高速离心后去除上清，保留沉淀Ⅱ；S5、采用消化缓冲液重新溶解所述沉淀Ⅱ，然后加入测序级的胰蛋白酶，经酶解即得血清/血浆蛋白质组样品；所述消化缓冲液中包含能打开二硫键的还原剂以及烷基化巯基的烷基化试剂。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述血清/血浆样品的用量为100μl～10000μl；所述低温低速离心的条件如下：离心力为800～1500RCF，温度为2～8℃，时间为5～20分钟。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述表面基团修饰的纳米颗粒中，所述表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒、所述氨基修饰的SiO2纳米颗粒、所述表面兼性离子修饰的SiO2与所述TiO2纳米颗粒的质量比为1：1～2：1～2：1～2；所述表面基团修饰的纳米颗粒的用量为0.5～2μg/μl所述血清/血浆样品；所述表面基团修饰的纳米颗粒的粒径为200～500nm。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中，加入所述表面基团修饰的纳米颗粒后于25～37℃下孵育30～120分钟。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤S3中，所述高速离心的条件如下：...

【专利技术属性】
技术研发人员：张万军，付斌，刘明伟，姜颖，任亮亮，张养军，秦伟捷，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：