氨基酸同位素标记物的定量分析方法技术

本发明专利技术属于氨基酸分析方法技术领域，具体公开了一种氨基酸同位素标记物的定量分析方法，包括以下步骤：包括以下步骤：S1、配制

【技术实现步骤摘要】
氨基酸同位素标记物的定量分析方法


[0001]本专利技术属于氨基酸分析方法
，尤其涉及一种氨基酸同位素标记物的定量分析方法。

技术介绍

[0002]氨基酸是蛋白质的基本组成单位，含有氨基官能团和羧基官能团，参与了人体多条代谢通路，所以针对氨基酸的分析技术对蛋白质化学、生物化学，乃至整个生命科学的研究都具有重要意义。
[0003]稳定同位素辅助代谢组学(简称SIAM)利用稳定同位素示踪剂标记的化合物(被标记化合物)研究物质转化或变化规律，具体原理为：由于被标记化合物与其相应的非标记化合物(被追踪物质)具有相同的化学和生物学性质，在生物机体内所发生的化学变化和生物过程也完全相同，所以将二者混合后，通过同位素丰度或比值的变化测出同种非标记化合物含量。
[0004]对于氨基酸来讲，稳定同位素标记的氨基酸是普通氨基酸中的一种或几种元素被稳定同位素(如
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C、
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N或2H)所取代，从而具有示踪性，将稳定同位素标记的氨基酸引入生物体内，通过测定代谢过程中氨基酸及其代谢产物的稳定同位素丰度变化，能够揭开生物体或细胞内代谢的理化过程，了解生物体的新陈代谢规律。
[0005]用于SIAM的技术平台主要是液相色谱
‑
质谱技术(简称LC
‑
MS)，但是LC
‑
MS存在以下问题：(1)共洗脱基质成分会引起离子抑制(基质是指样品中被分析物以外的组分，共洗脱基质是指与目标物共同出峰的基质成分)，从而降低被追踪物质的生成效率和离子强度，导致检测信号变弱，检测结果产生偏差；(2)基质会受微生物种类和前处理过程的影响，稀释样品法可以消除基质效应，但可能降低对低丰度代谢物的敏感性，具体原因在于：稀释是最简单的样品预处理技术，样品只需要用LC
‑
MS兼容的溶剂稀释即可，但是样品中所有组分都会进入LC
‑
MS系统，从而降低对低丰度代谢物的敏感性，所以稀释样品法只适用于基质效应不大且不存在灵敏度问题的情形。
[0006]GC
‑
MS较少用于SIAM，而且只能分析挥发性化合物，对非挥发性化合物需要首先进行氨基酸衍生化，降低氨基酸的沸点。常用的氨基酸衍生化方法是氯甲酸甲酯(MCF)衍生化和氯甲酸乙酯(ECF)衍生化。
[0007]由于氨基酸R基不同，氨基酸的化学性质存在较大差异，比如按照等电点pH可以将氨基酸分为酸性氨基酸、碱性氨基酸和中性氨基酸，所以采用气相色谱
‑
质谱技术(简称GC
‑
MS)测定氨基酸存在一定的困难，目前基于GC
‑
MS而建立的氨基酸数据库还不够完善，对揭开生物体或细胞内代谢的理化过程，了解生物体的新陈代谢规律存在较大的局限性。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种氨基酸同位素标记物的定量分析方法，以解决基于GC
‑
MS而建立的氨基酸数据库还不够完善，对揭开生物体或细胞内代谢的理化过程，了解生
物体的新陈代谢规律存在较大的局限性的技术问题。
[0009]为了达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：
[0010]氨基酸同位素标记物的定量分析方法，包括以下步骤：
[0011]S1、配制
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C培养基和
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C培养基；
[0012]S2、分别采用S1得到的
13
C培养基和S1得到的
12
C培养基培养细胞；
[0013]S3、细胞收集：弃去
12
C培养基和
13
C培养基，得到
13
C细胞和
12
C细胞进行衍生化前准备，得到
13
C样本和
12
C样本；
[0014]S4、MCF衍生化；
[0015]S5、采用GC
‑
MS对衍生化溶液进行分析，氦气流的流速为0.5
‑
1.5mL/min；进样口温度为270
‑
300℃；柱升温程序如下：GC烤箱设置为42
‑
48℃，维持1
‑
2min后，以5
‑
9℃/min速率升到170
‑
185℃，维持4
‑
8min后，以35
‑
45℃/min速率升到210
‑
230℃，维持4
‑
8min后，以30
‑
50℃/min速率升到240
‑
250℃，维持10
‑
15min后，以30
‑
50℃/min速率升到260
‑
290℃，维持1
‑
4min；质谱离子原的温度为140
‑
160℃；质谱四级杆温度为225
‑
235℃；连接杆温度为245
‑
255℃；
[0016]S6、数据挖掘获得氨基酸的碎片的荷质比、保留时间、
13
C可取代氨基酸的位置及个数，参见下表：
[0017][0018][0019]本技术方案的原理和有益效果在于：
[0020](1)本技术方案首先对氨基酸进行衍生化，然后通过严格控制柱升温程序、氦气流的流速和进样口温度，使各个氨基酸的峰充分分开，得到衍生化代谢物的特征离子荷质比，进一步扩展了GC
‑
MS的SIAM的数据库，有助于进一步直观观测细胞的代谢的变化情况，进一步准确反映细胞代谢改变，对于揭开生物体或细胞内代谢的理化过程，了解生物体的新陈代谢规律具有重要意义。
[0021](2)本技术方案通过计算
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C同位素在不同代谢物中的含量差异更精确，为计算
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C标记代谢物的利用率和转化率、分析代谢流提供更好的依据。
[0022](3)本技术方案的精密度高，RSD＜10％。
附图说明
[0023]图1为本专利技术实施例1中的衍生化原理图；
[0024]图2为本专利技术实施例1中丙氨酸的质谱图；
[0025]图3为本专利技术实施例1中甘氨酸的质谱图；
[0026]图4为本专利技术实施例1中缬氨酸的质谱图；
[0027]图5为本专利技术实施例1中亮氨酸的质谱图；
[0028]图6为本专利技术实施例1中异亮氨酸的质谱图；
[0029]图7为本专利技术实施例1中脯氨酸的质谱图；
[0030]图8为本专利技术实施例1中苏氨酸的质谱图；
[0031]图9为本专利技术实施例1中天冬氨酸的质谱图；
[0032]图10为本专利技术实施例1中谷氨酰胺的质谱图；
[0033]图11为本专利技术实施例1中组氨酸的质谱图；
[0034]图12为本专利技术实施例1中酪氨酸的质谱图。
具体实施方式
[0035]下面将结合本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.氨基酸同位素标记物的定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、配制
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C培养基和
12
C培养基；S2、分别采用S1得到的
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C培养基和S1得到的
12
C培养基培养细胞；S3、细胞收集：弃去
12
C培养基和
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C培养基，得到
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C细胞和
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C细胞进行衍生化前准备，得到
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C样本和
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C样本；S4、MCF衍生化；S5、采用GC
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MS对衍生化溶液进行分析，氦气流的流速为0.5
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1.5mL/min；进样口温度为270
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300℃；柱升温程序如下：GC烤箱设置为42
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48℃，维持1
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2min后，以5
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9℃/min速率升到170
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185℃，维持4
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8min后，以35
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45℃/min速率升到210
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230℃，维持4
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8min后，以30
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50℃/min速率升到240
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250℃，维持10
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15min后，以30
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50℃/min速率升到260
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290℃，维持1
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4min；质谱离子原的温度为140
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160℃；质谱四级杆温度为225
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235℃；连接杆温度为245
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255℃；S6、数据挖掘获得氨基酸的碎片的荷质比、保留时间、
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C可取代氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：季平，张华，韩顶立，杨洋，蒋汶容，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属口腔医院，
类型：发明
国别省市：