通用淀粉样蛋白相互作用基序(GAIM)制造技术

本发明专利技术涉及噬菌体基因3蛋白(g3p)的通用淀粉样蛋白相互作用基序(GAIM)的变体及其融合蛋白。本发明专利技术的GAIM变体和融合蛋白被部分或完全去免疫化，并显示出对多种多样的淀粉样蛋白的优异结合和特异性，以及表现出增强的淀粉样蛋白重构和对淀粉样蛋白聚集的抑制。本发明专利技术进一步涉及核酸、载体、宿主细胞以及制备GAIM变体及其融合蛋白的方法。本发明专利技术还涉及药物组合物和提高噬菌体感染性的方法，检测淀粉样蛋白聚集体的方法，以及诊断和/或治疗与错误折叠和/或聚集的淀粉样蛋白相关的疾病的方法。叠和/或聚集的淀粉样蛋白相关的疾病的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通用淀粉样蛋白相互作用基序(GAIM)
[0001]本申请要求于2018年6月15日提交的美国临时申请号62/685,757和2018年10月23日提交的美国临时申请号62/749,499的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。
[0002]本专利技术涉及多肽，其包含丝状噬菌体基因3蛋白(“g3p”，又被称为“p3”或“pIII”)的通用淀粉样蛋白相互作用基序(GAIM)的变体，使得所述多肽被部分或完全去免疫化，并显示出相对于现有技术的优异的效力、优异的结构稳定性以及增加的对淀粉样蛋白的结合特异性。涵盖了编码此类多肽的核酸分子和构建体，用此类核酸分子转化的宿主细胞，以及重组制备此类多肽的方法。另外，本专利技术涉及包含本文公开多肽的诊断组合物和药物组合物，涉及诊断组合物在检测淀粉样蛋白聚集体和/或诊断与错误折叠和/或聚集的蛋白有关的疾病中的用途，以及涉及药物组合物减少淀粉样蛋白负荷、防止淀粉样蛋白聚集、解聚淀粉样蛋白、或以其他方式治疗或预防与错误折叠和/或聚集的淀粉样蛋白有关的疾病，例如全身性和外周性淀粉样蛋白疾病、神经变性性疾病(包括神经变性性tau蛋白病)、以及传播性海绵状脑病(朊病毒相关疾病)的治疗和/或预防性用途。本专利技术的多肽包括融合蛋白及其淀粉样蛋白结合部分。
[0003]噬菌体g3p直接结合淀粉样蛋白纤维，并且噬菌体介导的淀粉样蛋白解聚(如，重构)取决于该初始结合步骤。参见，例如WO 2013/082114 A1，在此通过引用整体并入。专利技术人先前鉴定了淀粉样蛋白结合、淀粉样蛋白解聚和/或防止淀粉样蛋白聚集体形成所需的g3p的最小序列。同上。该最小序列被通用淀粉样蛋白相互作用基序(GAIM)所涵盖，所述通用淀粉样蛋白相互作用基序包含g3p的N1和N2域，并导致生成能够与淀粉样蛋白结合和/或解聚淀粉样蛋白的g3p多肽(包括其突变体、片段、融合蛋白或药物组合物)。参见同上；WO 2014/055515 A1，在此通过引用整体并入。WO 2013/082114 A1和WO 2014/055515 A1中公开的g3p多肽可有效预防或治疗与错误折叠和/或聚集的淀粉样蛋白相关的疾病。同上。然而，这些g3p多肽还包含人T细胞表位，其可在患者中引起不需要的免疫应答。因此，开发了部分去免疫化的g3p多肽，其包含去除天然g3p中存在的五个T细胞表位中多达四个的突变。参见WO 2014/193935 A1，在此通过引用整体并入。
[0004]此外，潜在的N
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糖基化位点的存在限制了g3p多肽在动物细胞中的重组产生，所述g3p多肽结合淀粉样蛋白，并可用于检测、诊断、预防或治疗淀粉样蛋白相关疾病或病况。因此，产生了改进的g3p多肽，包括部分去免疫化的g3p多肽，其中潜在的N
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糖基化位点通过一个或多个突变被去除。参见WO 2016/090022 A8，在此通过引用整体并入。
[0005]尽管取得了这些进展，但本领域仍然需要更稳定、有效和特异且完全或几乎完全去免疫化的g3p多肽。
[0006]到目前为止，产生具有这些治疗特性的多肽面临重大挑战，至少部分是由于g3p多肽中的某些反向关系：首先，我们先前试图去除T细胞表位2(其是g3p多肽的完全去免疫化所需的)一直导致淀粉样蛋白结合能力降低。其次，我们先前尝试提高GAIM的N1
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N2域的稳定性也一直导致淀粉样蛋白结合活性降低。例如，超稳定化的GAIM变体PB113显示淀粉样蛋白结合能力较差。第三，N2域的不稳定性驱动与非淀粉样蛋白底物，如可溶性蛋白、粘性熔球结构体和非淀粉样蛋白纤维聚合物如胶原蛋白和弹性蛋白的混杂相互作用。因此，使N2
脱稳定化(destabilize)以增加淀粉样蛋白结合活性牺牲了特异性，而使N2稳定化以避免脱靶结合牺牲了与淀粉样蛋白的结合。令人惊讶的是，所有这三种反向关系都是通过生成包含“开放稳定化(open
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stabilized)”构象的GAIM变体及其融合体的融合蛋白而克服。
[0007]与现有技术不同，本文所述的开放稳定化的多肽在一大批淀粉样蛋白中显示有效的淀粉样蛋白结合和重构(remodeling)活性，而保持蛋白稳定性和结合特异性。因此，在某些方面，本专利技术涉及开放稳定化的GAIM变体(GAIM)，GAIM
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免疫球蛋白(GAIM
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Ig)融合蛋白或它们的药物组合物，其至少部分去免疫化并且具有优异的淀粉样蛋白结合活性，淀粉样蛋白结合特异性和淀粉样蛋白重构活性。在一些方面，这些开放稳定化的GAIM变体、GAIM
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Ig融合蛋白或它们的药物组合物在不牺牲有效且特异的淀粉样蛋白结合和不牺牲结构稳定性的情况下完全去免疫化。本文所述的开放稳定化的GAIM变体和GAIM
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Ig融合体能够接合并去除脑和外周器官中的淀粉样蛋白，并构成一组新的多肽，其具有优异的检测、诊断、预防与错误折叠和/或聚集的淀粉样蛋白相关的疾病、延迟该疾病的发病和/或治疗该疾病的能力。
[0008]本专利技术的其它目的和优点部分地在下面的描述中阐述，并且从描述中将是显而易见的，或者可以通过实施本专利技术而获知。本专利技术的目的和优点将通过所附权利要求书中特别指出的要素和组合来实现和获得。应当理解的是，前面的总体描述和下面的详细描述都只是示例性和说明性的，并不限制所要求保护的专利技术。
[0009]附图简述
[0010]图1A是GAIM N1和N2域的三级结构的图形表示(使用PDB结构2G3P示出)。进行定点诱变的β链以深灰色显示。箭头指示N1中极性残基和N2中疏水性残基的位置。图1B是本专利技术的GAIM
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Ig融合体的图形表示。图1C是GAIM二聚体的图形表示。
[0011]图2描述显示fAβ42中GAIM相互作用序列的氢/氘(H/D)交换研究的结果。
[0012]图3A比较来自fd噬菌体的g3p的N1部分的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)和来自IF1噬菌体的g3p的相应N1部分的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的相应部分。空心框，在顶部描述PB106和GAIM支架PB120(衍生自PB106)的氨基酸23
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28(DDKTLD；SEQ ID NO:3)，在底部描述本专利技术的开放稳定化的GAIM
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Ig融合体中存在的EGDS(SEQ ID NO:4)取代(EGDS＝SEQ ID NO:4)。图3B是GAIM N1和N2域的三级结构的图形表示(使用PDB结构2G3P示出)。图3B中的空心框显示fd g3p中SEQ ID NO:3的位置。图3C是涉及N2域稳定化的三个慢折叠环(又称为“转角”)的图形表示。T1＝转角1(FQNN；SEQ ID NO:5)；T2＝转角2(RQGA；SEQ ID NO:6)；T3＝转角3(QGTDPVK；SEQ ID NO:7)。如下所示，通过诱变去除T1、T2或T3中的一个或多个使N2域稳定化。图3D描绘基于T50的选定氨基酸取代的结合和稳定性的变化。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.多肽，其包含起始氨基酸序列SEQ ID NO:16的变体，其中所述变体与SEQ ID NO:16的区别在于选自以下的一组或多组氨基酸变化：a)用任何氨基酸取代T50和H55T；b)N137G；c)N142A；d)R143V和Q144N；或R143V、Q144N和A146V；或R143V、Q144N和A146T；或R143V、Q144N和A146K；和e)Q156V、G157N、ΔT158、ΔD159、ΔP160和V161G；或Q156Y、G157N、ΔT158、ΔD159、ΔP160和V161G；或G157N、ΔT158、ΔD159、ΔP160和V161G；或ΔT158、ΔD159、ΔP160和V161G；任选地，其中所述变体与SEQ ID NO:16的区别还在于选自以下的一组或多组氨基酸变化：f)ΔM1；或ΔM1和ΔA2；和g)用除半胱氨酸以外的任何氨基酸取代N38；或用除半胱氨酸以外的任何氨基酸取代N38，和用除半胱氨酸以外的任何氨基酸取代G40；或用除半胱氨酸、苏氨酸或丝氨酸以外的任何氨基酸取代G40。2.权利要求1的多肽，其中所述T50取代选自下组：T50G、T50H、T50K和T50R。3.权利要求2的多肽，其中所述T50取代是T50H。4.权利要求1的多肽，其中所述变体与SEQ ID NO:16的区别至少在于ΔM1和ΔA2。5.权利要求1至4中任一项的多肽，其中所述变体与SEQ ID NO:16的区别至少在于N137G和/或N142A。6.权利要求4的多肽，其中所述变体与SEQ ID NO:16的区别还在于选自以下的一组或多组氨基酸变化：a)用任何氨基酸取代T50和H55T；和b)R143V和Q144N；或R143V、Q144N和A146V；或R143V、Q144N和A146T；或R143V、Q144N和A146K。7.权利要求6的多肽，其中所述T50取代选自下组：T50G、T50H、T50K和T50R。8.权利要求7的多肽，其中所述T50取代是T50H。9.权利要求1的多肽，其中所述SEQ ID NO:16的变体选自下组：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。10.权利要求1至9中任一项的多肽，其还包含免疫球蛋白恒定区。
11.权利要求10的多肽，其中所述免疫球蛋白恒定区序列是人IgG的Fc部分。12.权利要求11的多肽，其基本上由权利要求1至9中任一项的多肽和人IgG的Fc部分组成。13.权利要求12的多肽，其中所述人IgG是人IgG1。14.多肽，其基本上由选自以下的氨基酸序列组成：a)SEQ ID NO:29；b)SEQ ID NO:30；c)SEQ ID NO:31；d)SEQ ID NO:32；e)SEQ ID NO:33；f)SEQ ID NO:34；g)SEQ ID NO:35；和h)SEQ ID NO:36；任选地，其中所述变体具有选自以下的一组或多组氨基酸变化：i)ΔM1；或ΔM1和ΔA2；和j)ΔK485。15.药物组合物，其包含权利要求1至14中任一项的多肽和药学上可接受的载体。16.在有此需要的受试者中减少淀粉样蛋白、抑制淀粉样蛋白形成、抑制淀粉样蛋白聚集、或者去除和/或防止毒性寡聚物形成的方法，其包括向该受试者施用权利要求1至14中任一项的多肽或者权利要求15的药物组合物的步骤。17.权利要求16的方法，其中所述淀粉样蛋白或寡聚物包含选自以下的蛋白质：雄激素受体；载脂蛋白AI；载脂蛋白AII；载脂蛋白AIV；apo血清(aposerum)淀粉样蛋白A；Aβ；ABri；ADan；Atrophin
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1；心钠素；ataxin；降钙素；γ
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晶状蛋白；半胱氨酸蛋白酶抑制剂C；纤维蛋白原；凝溶胶蛋白；亨廷顿蛋白；胰岛素；胰岛淀粉样蛋白多肽；免疫球蛋白κ轻链；免疫球蛋白λ轻链；角膜
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上皮素；角蛋白；乳粘素；乳铁蛋白；溶菌酶；肺表面活性剂蛋白C；medin；牙源性成釉细胞相关蛋白；朊病毒蛋白；降钙素原；催乳素；精胶蛋白I；血清淀粉样蛋白A；超氧化物歧化酶I；β2
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微球蛋白；TATA盒结合蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：R克里什南，E艾斯普，M普罗奇斯基，R费希尔，
申请(专利权)人：普罗克拉拉生物科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：