一种基于CHA反应的光致电化学miRNA检测试剂盒的制备方法和产品技术

本发明专利技术属于基因检测领域，具体为一种基于CHA反应的光致电化学miRNA检测试剂盒的制备方法和产品，本发明专利技术的试剂盒中所构建的Mg

【技术实现步骤摘要】
一种基于CHA反应的光致电化学miRNA检测试剂盒的制备方法和产品


[0001]本专利技术属于基因检测领域，具体涉及一种基于CHA反应的光致电化学miRNA检测试剂盒的制备方法和产品。

技术介绍

[0002]光致电化学(Photoelectrochemistry，PEC)是指在光的作用下，电极或界面材料受到的影响及在此过程中伴随的光能、电能和化学能之间转化的科学。光致电化学是在电化学的基础上发展起来的，主要包括两个过程：光电转换过程和电化学过程。光电转换过程是光致电化学研究的核心。当具有光电化学活性的物质吸收光子而处于激发态时，电子由价带跃迁至导带，价带上留下空穴，即产生光生电子
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空穴对，通过与体系中存在的分子发生电子交换，会产生电荷分离现象，而分离的电子空穴会分别向电极表面、电极材料及电解质溶液界面转移，从而产生光电流或光电压。构建再生型的光电传感器已逐渐成为发展趋势，通常的再生策略耗时、操作繁琐且成本高昂。引入无任何修饰的核酸单链即可实现传感器再生，可使得再生过程简单快速、再生效率高、灵敏度良好。
[0003]目标物诱导的核酸循环放大技术是指通过酶的剪切、聚合作用或DNA链置换反应，释放出被识别元件捕获的目标物，并参与下一轮捕获、释放过程，实现对单个目标物的多次循环利用，达到目标物与输出信号为1：n的信号放大作用。通常有聚合酶链式反应(polymerase chainreaction，PCR)、滚环扩增技术(rolling circle amplification，RCA)、催化发夹自组装循环(catalytic hairpin assembly，CHA)、链取代放大技术(strand displacement amplification，SDA)、核酸酶辅助的酶切循环放大等，通过热变性或等温的方法，在聚合酶及其他核酸酶的参与下，合成出数量巨大的目标或目标相关的DNA序列，从而实现对低含量目标物的高灵敏检测。
[0004]金属有机框架化合物(metal
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organic frameworks，MOFs)又称多孔配位聚合物(porous coordination polymers，PCP)或多孔配位网络(porous coordination networks，PCN)，是一种由金属节点和有机配体通过配位作用形成的新型多孔框架材料。由于MOFs具有结构稳定、有序、孔径尺寸可调以及比表面积大等优点，受到科学家的广泛关注和研究，其在气体吸附和储存、催化、化学传感器、药物运输以及能量存储与转换等领域均有较好的应用前景。JaesoolShim课题组研究了基于多种MOFs的高效多相光催化作用。与普通的MOFs材料相较，以具有优异光电性能的苝四甲酸(PTCA)为配体合成的MOFs材料(PTCA MOFs)具有更高的电子捕获能力和光电转换效率。将合成的PTCA MOFs用于构建超灵敏PEC生物传感器，具有重要的理论意义和实际应用价值。
[0005]MicroRNA(miRNA)是一类内生的、短的、非编码单链核糖核酸分子，长度约19
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23个核苷酸。miRNA调控着人体约三分之一的基因，并可参与动植物中转录后基因的表达调控。miRNA的准确定量对于疾病诊断、预后和治疗具有非常重要的意义。然而，因其在机体内的含量低，通常情况下难以对其进行精确测定。miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包
括早期发育、细胞增殖、细胞凋亡、脂肪代谢和细胞分化等。其含量与乳腺癌、神经胶质瘤和食管鳞状细胞癌等息息相关。现已报道了一系列检测miRNA的方法，但由于miRNA具有亚型、超低表达和高序列同源性等特点，所以对传感器的选择性和检测限等性能提出了更高的要求。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种基于CHA反应的光致电化学miRNA检测试剂盒的制备方法；本专利技术的目的之二在于提供一种基于CHA反应的miRNA检测试剂盒；本专利技术的目的之三在于提供一种基于CHA反应的miRNA检测试剂盒的使用方法。
[0007]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]1、一种基于CHA反应的光致电化学miRNA检测试剂盒的制备方法，所述试剂盒包括工作电极和检测液，所述检测液包括检测液I和检测液II，所述方法包括如下步骤：
[0009](1)制备工作电极
[0010]1)合成Mg
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PTCAMOFs复合物
[0011]KOH水溶液加热后搅拌加入苝四甲酸二酐，反应后冷却至室温，调节pH，离心洗涤，蒸馏水重悬，得到苝四甲酸溶液；将全部苝四甲酸溶液与MgCl2·
6H2O加入N，N
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二甲基甲酰胺
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1，4
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二氧己环
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蒸馏水中，加入HCl，搅拌后反应，匀速降温，离心洗涤，无水乙醇溶解，得到Mg
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PTCA MOFs复合物；
[0012]2)修饰电极
[0013]在玻碳电极表面滴涂步骤1)制备的Mg
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PTCA MOFs复合物，干燥后分别滴加1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和N
‑
羟基琥珀酰亚胺溶液，反应后滴加捕获探针，过夜孵育，再用6
‑
巯基己醇封闭非特异性结合位点，制得工作电极；
[0014](2)制备检测液
[0015]在含有H1的溶液中分别加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和N
‑
羟基琥珀酰亚胺溶液，以活化H1上的羧基，再加入MBs，搅拌过夜，磁性分离，取沉淀，PBS重悬，得到检测液I；
[0016]将HAuCl4溶液与次级目标物DNA混合，震荡、陈化，再加入二甲胺硼烷，震荡，得到次级目标物溶液，将次级目标物溶液与含有H2的溶液混合，分别加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和N
‑
羟基琥珀酰亚胺溶液，反应后，再加入ZnO NPs溶液，震荡后离心分离，将获得的沉淀分散于PBS中，得到检测液II；
[0017]所述H1含有待测miRNA和H2的互补序列，所述H1与所述H2能发生CHA反应；
[0018]所述次级目标物DNA上含有Au NCs辅助合成序列和所述再生DNA的互补序列，所述再生DNA与所述捕获探针为互补序列。
[0019]优选的，步骤1)中，将20mL 5％KOH水溶液加热至65℃后，搅拌加入0.05g苝四甲酸二酐，反应10
‑
20min，冷却至室温，调pH为3
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4，离心洗涤，蒸馏水重悬，得到苝四甲酸溶液；将全部所述苝四甲酸溶液与30mg MgCl2·
6H2O加入8本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CHA反应的光致电化学miRNA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒包括工作电极和检测液，所述检测液包括检测液I和检测液II，所述方法包括如下步骤：(1)制备工作电极1)合成Mg
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PTCA MOFs复合物KOH水溶液加热后搅拌加入苝四甲酸二酐，反应后冷却至室温，调节pH，离心洗涤，蒸馏水重悬，得到苝四甲酸溶液；将全部苝四甲酸溶液与MgCl2·
6H2O加入N,N
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二甲基甲酰胺—1,4
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二氧己环—蒸馏水中，加入HCl，搅拌后反应，匀速降温，离心洗涤，无水乙醇溶解，得到Mg
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PTCA MOFs复合物；2)修饰电极在玻碳电极表面滴涂步骤1)制备的Mg
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PTCA MOFs复合物，干燥后分别滴加1
‑
(3
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二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和N
‑
羟基琥珀酰亚胺溶液，反应后滴加捕获探针，过夜孵育，再用6
‑
巯基己醇封闭非特异性结合位点，制得工作电极；(2)制备检测液在含有H1的溶液中分别加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和N
‑
羟基琥珀酰亚胺溶液，以活化H1上的羧基，再加入MBs，搅拌过夜，磁性分离，取沉淀，PBS重悬，得到检测液I；将HAuCl4溶液与次级目标物DNA混合，震荡、陈化，再加入二甲胺硼烷，震荡，得到次级目标物溶液，将次级目标物溶液与含有H2的溶液混合，分别加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和N
‑
羟基琥珀酰亚胺溶液，反应后，再加入ZnO NPs溶液，震荡后离心分离，将获得的沉淀分散于PBS中，得到检测液II；所述H1含有待测miRNA和H2的互补序列，所述H1与所述H2能发生CHA反应；所述次级目标物DNA上含有Au NCs辅助合成序列和所述再生DNA的互补序列，所述再生DNA与所述捕获探针为互补序列。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，将20mL 5％KOH水溶液加热至65℃后，搅拌加入0.05g苝四甲酸二酐，反应10
‑
20min，冷却至室温，调pH为3
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4，离心洗涤，蒸馏水重悬，得到苝四甲酸溶液；将全部所述苝四甲酸溶液与30mg MgCl2·
6H2O加入8mL体积比为2:1:1的N,N
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二甲基甲酰胺—1,4
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二氧己环—蒸馏水中，加入20μL 1.2mol/L HCl，搅拌10
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20min后，90℃下反应70
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80h；以5℃/h的速率冷却至室温，离心洗涤后，无水乙醇溶解，得到Mg
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【专利技术属性】
技术研发人员：傅英姿，莫方静，陈敏，孟辉，郭江，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：