端粒酶全酶复合体及其使用方法技术

本公开内容描述了纯化的端粒酶全酶及其向细胞(例如T细胞)的递送，以用于延长端粒长度、提高细胞增殖和阻止细胞衰老。提高细胞增殖和阻止细胞衰老。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】端粒酶全酶复合体及其使用方法
[0001]优先权声明
[0002]本申请要求于2018年9月6日提交的美国临时申请序列号62/727,743的优先权权益，其全部内容通过引用在此并入。
[0003]背景
1.

[0004]本公开内容涉及细胞生物学、分子生物学、蛋白质生物学和医学的领域。更具体地，其描述了端粒酶全酶复合体(telomerase holoenzyme complex)的产生及其向细胞的递送，以减慢或纠正端粒变短。
2.
技术介绍

[0005]端粒是加帽于线性染色体末端以保扩它们免于降解并防止染色体融合的串联重复序列[1]。在正常的人增殖细胞中，端粒随着每次细胞分裂逐渐地变短[2]，最终导致DNA损伤应答、复制性衰老或凋亡[3]。增殖的一个结果是端粒长度随年龄而缩短[4]并且被认为是生物学(非时序)年龄的生物标志物[5]，所述生物学(非时序)年龄也与多种与年龄相关的病理状况，包括癌症[3]、痴呆[6，7]和心血管病[5]相关。最近在小鼠中的研究已表明，通过防止端粒变短(衰老的单一标志)，健康寿命和寿限二者均会提高[8，9]。
[0006]端粒酶，即参与在端粒末端从头添加端粒TTAGGG重复序列的逆转录酶，是包含两种主要组分，催化蛋白亚基(TERT)和模板RNA(TR或TERC)的一种核糖核蛋白酶复合体。在人中，TERT仅在正常地能够长期增殖的细胞(例如，增殖的非静止干细胞)中表达，但不在正常分化的体细胞中表达，活化的淋巴细胞除外[10，11]。
[0007]T淋巴细胞(T细胞)是免疫系统中主要以静止的非增殖状态循环，但在被抗原或非特异性刺激活化时迅速分裂的核心细胞类型[11]。在体外，T细胞可响应于特异性抗原或非特异性(促分裂的抗CD3和抗CD28抗体)刺激而活化并增殖[11]。在体外和体内两种情况下，端粒酶活性在活化的人T细胞中瞬时上调，但该端粒酶不足以抵消迅速细胞扩增期间端粒的损失，最终导致复制性衰老[11，12]。因此，端粒长度和再激活端粒酶活性的能力是确定T细胞寿限以及肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor
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infiltrating lymphocyte，TIL)的抗肿瘤活性的关键因素，所述TIL在具有健康免疫应答的患者中介导肿瘤的消退[13，14]。实际上，具有较长端粒的TIL能够在体内持续更长时间并介导更稳健的抗肿瘤作用[15]。
[0008]人抗原特异性T细胞由于其抗肿瘤能力正越来越多地用作过继免疫治疗的主要工具以治疗多种形式的癌症和感染性疾病，例如AIDS[16，17]。现在，可用癌症抗原特异性T细胞受体基因修饰患者的自体T
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细胞，随后将经修饰且经体外扩增的T细胞过继转移回宿主。然而，在长时期的体外培养和扩增之后，经修饰的T细胞在体内的复制潜能有限，并且最终进入衰老状态(T细胞耗竭)，这是端粒DNA逐渐损失的结果。由于衰老细胞具有用于免疫治疗的相当有限的潜能，因此提供在体外迅速扩增期间高效地保护T细胞免于端粒损失的手段的技术对于抗原特异性T细胞以及许多其他类型的细胞的成功临床应用将是高度有利
的。

技术实现思路

[0009]如下所述，本专利技术人已经成功地改造了经生物素标记的重组hTERT，并使其与hTR(端粒酶的功能性RNA组分)一起在人细胞系H1299中过表达。他们还开发了3步纯化操作策略，以从细胞裂解物中纯化重组端粒酶。这种多步纯化操作允许本专利技术人获得高度富集的催化活性酶。重要地，本专利技术人使用了其开发的生物素标签，该标签不仅使端粒酶(hTERT+hTR)牵出(pull down)，而且还使包含其他必需端粒酶相关蛋白(例如角化不良蛋白(DKC1)、核糖核蛋白NOP 10和NHP2)的完整重组端粒酶全酶复合体牵出。通过使用细胞穿透肽(cell
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penetrating peptide)与由NaCl介导的高渗量诱导的主动摄取机制的组合，本专利技术人将纯化的端粒酶全酶递送至正常的年轻和衰老的人细胞(例如，经抗原刺激的外周血单个核细胞和肺成纤维细胞)。所递送的端粒酶在细胞质和核区室二者中均保持强活性。本专利技术人还表明在体外端粒酶的三次连续递送(每3天)足以显著延长端粒长度和细胞复制寿限二者。重要地，该处理不能使细胞永生或转化，其最终经历衰老，并且所递送的端粒酶全酶在有限的时间窗(至多24至36小时)内保持活性。该人重组端粒酶全酶可用于瞬时延长端粒，并因此延长衰老人细胞的复制寿限。
[0010]因此，根据本公开内容，提供了延长端粒长度和/或提高细胞增殖能力的方法，其包括：(i)提供细胞群；(ii)使所述细胞群的至少第一部分与纯化的重组端粒酶全酶接触；以及(iii)测量来自所述第一部分的细胞中受端粒长度调节的一个或更多个靶基因的表达。该方法可还包括(iv)当与未处理细胞(例如来自所述细胞群的第二部分的未处理细胞)相比，一个或更多个所述靶基因显示出指示端粒酶活性的表达谱时，将来自所述第一部分的第二细胞引入到对象中。
[0011]该方法可还包括在步骤(ii)之前，测量所述细胞群的第三细胞中受端粒长度调节的一个或更多个靶基因的表达。一个或更多个靶基因可以是ISG15、TEAD4、PD
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1和/或BAX。细胞群可以是PBMC。细胞群可以是T细胞，例如CD3
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/CD28
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T细胞。该方法可还包括在步骤(i)之前从对象中取出所述细胞群。对象可以是人对象或人源化小鼠，例如具有脐带血干细胞的NOD SCIDγ小鼠。端粒酶全酶可以与细胞穿透肽偶联。
[0012]在另一个实施方案中，提供了提高细胞增殖能力的方法，其包括：(i)提供细胞群；(ii)使所述细胞群的所述第一部分与重组端粒酶全酶接触；(iii)测量来自所述第一部分的第一细胞在触发衰老或凋亡之前进行的细胞分裂总次数；(iv)测量来自所述细胞群的第二但未经端粒酶处理的部分的细胞在触发衰老或凋亡之前进行的细胞分裂总次数；以及(v)确定来自所述第一部分的第二细胞是否不表现出癌症特征。该方法可还包括当步骤(iii)中测量的细胞分裂总次数大于步骤(iv)中的时，并且当来自所述第一部分的所述第二细胞不表现出癌症特征时，将来自所述第一部分的第三细胞引入到对象中。
[0013]该方法可还包括测量端粒长度和/或受端粒长度调节的一个或更多个靶基因的表达，(a)作为步骤(iii)的一部分，或者(b)在步骤(ii)之前如果有来自所述细胞群的第四细胞的话。一个或更多个靶基因可以是ISG15、TEAD4、PD
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1和/或BAX。细胞群可以是PBMC。细胞群可以是T细胞，例如CD3
+
/CD28
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T细胞。该方法可还包括在步骤(i)之前从对象中取出所述细胞群。对象可以是人对象或人源化小鼠，例如具有脐带血干细胞的NOD SCIDγ小鼠。端粒
酶全酶可以与细胞穿透肽偶联。
[0014]考虑了本文中所述的任何方法或组合物可相对于本文中所述的任何其他方法或组合物来实施。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.延长端粒长度和/或提高细胞增殖能力的方法，其包括：(i)提供细胞群；(ii)使所述细胞群的至少第一部分与纯化的重组端粒酶全酶接触；以及(iii)测量来自所述第一部分的细胞中受端粒长度调节的一个或更多个靶基因的表达。2.权利要求1所述的方法，其还包括：(iv)当与未处理细胞例如来自所述细胞群的第二部分的未处理细胞相比，一个或更多个所述靶基因显示出指示端粒酶活性的表达谱时，将来自所述第一部分的第二细胞引入到对象中。3.权利要求1或2所述的方法，其还包括在步骤(ii)之前测量所述细胞群的第三细胞中受端粒长度调节的一个或更多个靶基因的表达。4.权利要求1至3所述的方法，其中所述一个或更多个靶基因是ISG15、TEAD4、PD
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1和/或BAX。5.权利要求1至4所述的方法，其中所述细胞群是PBMC。6.权利要求1至4所述的方法，其中所述细胞群是T细胞，例如CD3
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/CD28
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T细胞。7.权利要求1所述的方法，其还包括在步骤(i)之前从对象中取出所述细胞群。8.权利要求2至7所述的方法，其中所述对象是人对象。9.权利要求2至8所述的方法，其中所述对象是人源化小鼠，例如具有脐带血干细胞的NOD SCIDγ小鼠。10.权利要求1至9所述的方法，其中所述端粒酶全酶与细胞穿透肽偶联。11.提高细胞增殖能力的方法，其包括：(i)提供细胞群；(ii)使所述细胞群的所述第一部分与重组端粒酶全酶接触；(iii)测量来自所述第一部分的第一细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰里，
申请(专利权)人：德克萨斯大学系统董事会，
类型：发明
国别省市：