一种脑胶质母细胞瘤体内替莫唑胺耐药模型的构建方法及耐药细胞的获取方法技术

本发明专利技术提供了一种脑胶质母细胞瘤体内替莫唑胺耐药模型的构建方法及耐药细胞的获取方法，涉及动物模型技术领域。本发明专利技术通过将PDX、3D培养和PCX结合，构建3D

【技术实现步骤摘要】
一种脑胶质母细胞瘤体内替莫唑胺耐药模型的构建方法及耐药细胞的获取方法


[0001]本专利技术属于动物模型
，具体涉及一种脑胶质母细胞瘤体内替莫唑胺耐药模型的构建方法及耐药细胞的获取方法。

技术介绍

[0002]胶质母细胞瘤(glioblastomamultiform，GBM)是最常见的、恶性程度最高的原发性脑肿瘤。GBM治疗通常采用手术和放化疗相结合的方式，但就目前临床数据来看，即使采用了最为积极的治疗手段，GBM患者的中位生存期仍少于15个月。替莫唑胺(temozolomide，TMZ)作为临床治疗GBM的标准一线化疗药物，能够快速通过血脑屏障发挥其抗肿瘤作用。然而，约55％的胶质瘤患者由于对其原发性耐药，并未从TMZ化疗中受益，除此之外，在TMZ使用过程中出现的继发性耐药也进一步限制了其临床应用。因此，建立TMZ相关的GBM耐药模型是研究GBM耐药机制的基础，对增加临床治疗效果，提高患者长期存活率和改善生活质量具有重要意义。
[0003]传统的GBM耐药模型的构建通常基于体外培养的细胞株，通过药物干预诱导其逐步产生药物抗性并加以维持，再对所获得的耐药细胞株进行功能学、分子遗传学等相关体内外研究。但是，这种体外细胞培养为主导的耐药模型仅注重于药物对细胞群落的刺激，忽略了肿瘤组织整体和肿瘤局部微环境等因素对肿瘤耐药的影响，往往不能反映真实的体内情况。除此之外，由于肿瘤组织进化和异质性等因素，商业化的细胞株在生物学特性和遗传学背景上与患者肿瘤组织有极大的差异，且细胞类型和遗传背景相对单一，忽视了原有肿瘤组织的异质性和多样性。最为关键的是，TMZ作为GBM一线化疗药物本身并不直接发挥作用，需要在人体内的生理pH下水解为5
‑
(3
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甲基三氮烯
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1)咪唑
‑4‑
酰胺进而发挥抗肿瘤作用，因此体外TMZ诱导细胞株耐药周期长，效果不明显，很难获得稳定的GBM耐药模型，而用其他抗肿瘤药物进行诱导又无法模拟真实的临床用药情况。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种脑胶质母细胞瘤体内替莫唑胺耐药模型的构建方法及耐药细胞的获取方法，模型构建方法简单，且构建的模型能够最大程度的模拟体内药物代谢以及肿瘤组织自身微环境对肿瘤耐药的影响，并且可以通过原代培养的方式获得相关耐药细胞株进行体外相关实验，保证体内外实验的稳定性和一致性。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种脑胶质母细胞瘤体内替莫唑胺耐药模型的构建方法，包括以下步骤：(1)将患者来源的胶质母细胞瘤组织消化后，接种于3D培养板上培养成细胞球；
[0007](2)将所述细胞球消化成单个细胞悬液，以5
×
106/200μl的密度接种至裸鼠体内，获得基于GBM患者来源的3D
‑
PCX模型；
[0008](3)待所述3D
‑
PCX模型的体内肿瘤长至100mm3大小后，隔天给药，诱导耐药后，将
肿瘤组织在裸鼠体内连续传代，获得所述脑胶质母细胞瘤体内替莫唑胺耐药模型；所述给药时替莫唑胺的给药量为20mg/kg。
[0009]优选的，步骤(1)所述消化，包括利用HBSS培养基清洗所述胶质母细胞瘤组织后剪碎，与等体积的胰酶溶液混合消化；所述胰酶溶液的质量百分含量为0.125％。
[0010]优选的，步骤(1)所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为12～18min。
[0011]优选的，步骤(1)所述接种包括接种于96孔的3D培养板中，每孔400个细胞，用干细胞培养基或者DOBA培养基培养。
[0012]优选的，所述培养的温度为37℃，每培养24h观察一次细胞球的形成情况，至细胞球长至100μm大小时，停止培养。
[0013]优选的，在所述培养期间，每两天更换一次培养基。
[0014]优选的，步骤(3)所述连续传代包括取出体内肿瘤组织，清洗后剪碎转移至新的裸鼠体内，待肿瘤长至100mm3后，重复给药；所述连续传代的次数为2～5次。
[0015]本专利技术还提供了一种脑胶质母细胞瘤体内替莫唑胺耐药细胞的获取方法，包括以下步骤：(a)取出利用上述构建方法构建得到的所述脑胶质母细胞瘤体内替莫唑胺耐药模型的肿瘤组织，清洗后剪碎，与10倍体积的胰酶溶液混合消化；
[0016](b)终止消化后离心，弃上清，重悬后过200目筛，得所述耐药细胞的溶液。
[0017]优选的，步骤(a)胰酶溶液的质量百分含量为0.125％；所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为12～18min。
[0018]优选的，步骤(b)所述离心的转速为1000rpm，离心的时间为15min。
[0019]本专利技术提供了一种脑胶质母细胞瘤(GBM)体内替莫唑胺(TMZ)耐药模型的构建方法，将PDX、3D培养和PCX结合，构建3D
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PCX模型，并在此模型的基础上，构建基于3D
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PCX的GBM体内TMZ耐药模型。本专利技术所述构建方法操作简单，能够最大程度的模拟患者体内TMZ药物代谢以及肿瘤组织自身微环境对肿瘤耐药的影响，同时保证了原有肿瘤组织的异质性和多样性；并且可以通过原代培养的方式获得相关耐药细胞株进行体外相关实验，保证了体内外实验的稳定性和一致性。
[0020]本专利技术所述GBM体内TMZ耐药模型在3D
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PCX模型的基础上进行构建，由于3D培养的细胞球可以冻存和扩增，对后续的PCX造模有很大的灵活性，既保留了PDX模型具有较好的临床疗效预测性的优点，又在一定程度上克服了其肿瘤组织活性要求高，必须立即进行移植等缺点，缩短了模型构建的周期。利用本专利技术所述构建方法获得的稳定耐药模型不仅可以通过高通量测序、芯片、组学等手段研究耐药相关的分子事件、分子标签和生物标志物，也可作为功能学研究和靶向药物筛选的有利工具。
附图说明
[0021]图1为基于GBM患者来源的3D细胞培养结果；
[0022]图2为基于GBM患者来源的3D
‑
PCX模型的肿瘤生长体积曲线；
[0023]图3为基于3D
‑
PCX模型的体内TMZ耐药模型的肿瘤生长体积曲线；
[0024]图4为不同抗肿瘤药物的体外细胞毒性实验结果；
[0025]图5为TMZ体内抗肿瘤实验结果。
具体实施方式
[0026]本专利技术提供了一种脑胶质母细胞瘤体内替莫唑胺耐药模型的构建方法，包括以下步骤：(1)将患者来源的胶质母细胞瘤组织消化后，接种于3D培养板上培养成细胞球；
[0027](2)将所述细胞球消化成单个细胞悬液，以5
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106/200μl的密度接种至裸鼠体内，获得基于GBM患者来源的3D
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PCX模型；
[0028](3)待所述3D
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PCX模型的体内肿瘤长至1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脑胶质母细胞瘤体内替莫唑胺耐药模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将患者来源的胶质母细胞瘤组织消化后，接种于3D培养板上培养成细胞球；(2)将所述细胞球消化成单个细胞悬液，以5
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106/200μl的密度接种至裸鼠体内，获得基于GBM患者来源的3D
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PCX模型；(3)待所述3D
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PCX模型的体内肿瘤长至100mm3大小后，隔天给药，诱导耐药后，将肿瘤组织在裸鼠体内连续传代，获得所述脑胶质母细胞瘤体内替莫唑胺耐药模型；所述给药时替莫唑胺的给药量为20mg/kg。2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(1)所述消化，包括利用HBSS培养基清洗所述胶质母细胞瘤组织后剪碎，与等体积的胰酶溶液混合消化；所述胰酶溶液的质量百分含量为0.125％。3.根据权利要求1或2所述构建方法，其特征在于，步骤(1)所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为12～18min。4.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(1)所述接种包括接种于96孔的3D培养板中，每孔400个细胞，用干细胞培养基或者DOB...

【专利技术属性】
技术研发人员：张博，邹健，殷莹，张真豪，浦浙宁，万权，
申请(专利权)人：无锡市人民医院，
类型：发明
国别省市：