一种达巴万星前体A40926B0高产菌株及应用制造技术

本发明专利技术提供一种达巴万星前体A40926B0高产菌株及应用，所述高产菌株分类命名为：哥伦扎诺野野村菌L71(Nonomuraea gerenzanensis)，保藏号：CGMCC No.21334。通过将A40926B0生物合成基因簇导入出发菌株中，产生的次级代谢产物，经酯化、酰胺化、水解三步反应合成后筛选得到，产量比出发菌株提高50％～55％。达巴万星为新型半合成糖肽抗生素，能抑制革兰氏阳性菌细胞壁的生物合成，适用于治疗急性细菌性皮肤和皮肤结构感染。本发明专利技术的哥伦扎诺野野村菌L71能提高达巴万星前体A40926B0产量。本发明专利技术使用范围广泛，为放线菌药物高效生物合成途径的构建提供一种新的研究方法。

【技术实现步骤摘要】
一种达巴万星前体A40926B0高产菌株及应用
本专利技术属于微生物制药领域，涉及一种达巴万星前体A40926B0高产菌株及应用。
技术介绍
由于细菌耐药性问题日趋突出，如金葡球菌对β一内酰胺类抗生素及万古霉素耐药株的增加，肠球菌对β-内酰胺类、氨基糖苷类抗生素以及万古霉素耐药株的增加；替考拉宁与万古霉素存在部分交叉耐药的情况，以及一些肠球菌具有中度或高度传递性耐药性的能力等，寻找新的糖肽类抗生素已成为临床治疗迫切的需要。达巴万星(Dalbavancin)于2014年由DurataTherapeutics公司申请获美国FDA批准上市，商品名为Dalvance，是首个获批用于急性细菌性皮肤和皮肤结构感染治疗的双剂量方案的静脉注射抗生素。临床试验表明，达巴万星对于青霉素敏感和耐药的肺炎链球菌均表现出高度敏感的抗菌效果，是能治疗多重耐药的金黄色葡萄球菌和肠球菌属感染性疾病的少数药物之一，且具有万古霉素和替考拉宁没有的抗淋病奈瑟球菌的作用。哥伦扎诺野野村菌L70是达巴万星前体A40926B0的生产菌株，目前发酵产量低。因此利用合成生物学理念与技术进行基因工程改造以提高A40926B0的发酵产量，对达巴万星产业化具有重要意义。
技术实现思路
一种达巴万星前体A40926B0高产菌株本专利技术的目的是提供一种达巴万星前体A40926B0高产菌株，为哥伦扎诺野野村菌L71，分类命名为：NonomuraeagerenzanensisL71，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号：CGMCCNo.21334，保藏日：2020年12月7日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术的另一目的是提供一种达巴万星前体A40926B0高产工程菌株的构建方法，包括将A40926B0生物合成基因簇导入出发菌株哥伦扎诺野野村菌L70，筛选获得高产A40926B0的基因工程菌株哥伦扎诺野野村菌L71。出发菌株哥伦扎诺野野村菌L70保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCCNo.21333，分类命名：哥伦扎诺野野村菌(Nonomuraeagerenzanensis)，保藏日期：2020年12月7日。本专利技术构建方法具体步骤如下：(1)设计特异性引物以哥伦扎诺野野村菌L70基因组BAC文库为模板，扩增SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3，筛选包含完整A40926B0生物合成基因簇序列的单克隆菌落：上部筛选引物SEQIDNO.4：CGTTGAACTGGGTGGACATG，SEQIDNO.5：TGGGACCTGCTGGAGGAG内部筛选引物SEQIDNO.6：GCAACATGGTTGTCAGTCTG，SEQIDNO.7：CTCTCGGTAGAGATCCACTTC下部筛选引物SEQIDNO.8：GTAGTGGATGGCGAGCCAC，SEQIDNO.9：GCTGGTACGGGACAAGGTC。(2)步骤(1)中筛选到的包含完整A40926B0生物合成基因簇表达载体pMSBBAC1-A40926-1的单克隆菌落通过双亲本接合转移转入大肠杆菌E.coilET12567/pUB307中；(3)通过双亲本接合转移将步骤(2)中的质粒转入出发菌株哥伦扎诺野野村菌L70中；(4)通过发酵筛选获得高效生产A40926B0的基因工程菌株哥伦扎诺野野村菌L71，产量达320mg/L。上述方法中，步骤(2)-(3)将筛选到的包含完整A40926B0生物合成基因簇质粒pMSBBAC1-A40926-1导入出发菌株哥伦扎诺野野村菌L70中。上述方法中，步骤(1)中SEQIDNO.1由463个核苷酸组成，位于A40926B0生物合成基因簇第一个基因dbv1上游距离13787bp处；SEQIDNO.2由353个核苷酸组成,位于A40926B0生物合成基因簇第21个基因dbv21下游距离119bp处；SEQIDNO.3由496个核苷酸组成，位于A40926B0生物合成基因簇第37个基因dbv37下游距离19571bp处。上述方法中，步骤(2)中将筛选到包含完整A40926B0生物合成基因簇表达载体的单克隆菌落通过双亲本接合转移转入大肠杆菌；步骤(3)中将表达载体利用大肠杆菌进行双亲接合获得所述的高产达巴万星前体A40926B0基因工程菌株哥伦扎诺野野村菌L71。上述方法中，步骤(3)所述作为出发菌株为哥伦扎诺野野村菌L70，步骤(2)所述大肠杆菌为E.coilET12567/pUB307。上述方法中，经筛选得到的高产达巴万星前体A40926B0基因工程菌株哥伦扎诺野野村菌L71产量比出发菌高50％～55％，达320mg/L。本专利技术的再一个目的是提供所述哥伦扎诺野野村菌L71(Nonomuraeagerenzanensis)在提高达巴万星的前体A40926B0产量中的应用。达巴万星前体A40926B0可制备治疗导管相关的血源性感染以及皮肤和软组织感染药物。本专利技术从土壤分离获得一株产达巴万星前体A40926B0的哥伦扎诺野野村菌，但该菌株A40926B0产量低，不适合工业应用。本专利技术所述的高产达巴万星前体A40926B0的基因工程菌株哥伦扎诺野野村菌L71(NonomuraeagerenzanensisL71)，经过发酵可大量生产治疗导管相关的血源性感染以及皮肤和软组织感染的药物达巴万星的前体A40926B0，其产量比出发菌提高50％～55％，高达320mg/L，具有很好的应用前景，可推进达巴万星产业化开发。本专利技术的优点是：(1)本专利技术基于基因工程手段通过增加一个A40926B0生物合成基因簇拷贝数，获得了高产达巴万星前体A40926B0的基因工程菌株哥伦扎诺野野村菌L71，从而克服了传统诱变育种中产生的耗时长、工作量大、效率低等问题。(2)本专利技术所构建的高产达巴万星前体A40926B0的基因工程菌株哥伦扎诺野野村菌L71产量比出发菌株高50％～55％，达320mg/L，大大降低了达巴万星前体A40926B0的生产成本，对达巴万星的工业化生产具有重要的应用价值与指导意义。本专利技术通过体内基因工程改造技术构建了高产达巴万星前体A40926B0的基因工程菌株哥伦扎诺野野村菌L71，该方法操作简便，应用高效且具有一定的普适性，为微生物药物高效生物合成提供了一种新的技术手段。所述的达巴万星前体A40926B0的基因工程菌株哥伦扎诺野野村菌L71可在制备治疗导管相关的血源性感染以及皮肤和软组织感染药物中应用。附图说明图1是哥伦扎诺野野村菌L70和哥伦扎诺野野村菌L71在发酵过程中A40926B0生物量曲线。图2是哥伦扎诺野野村菌L70和哥伦扎诺野野村菌L71在发酵过程中A40926B0发酵产量曲线。图3是哥伦扎诺野野村菌L71的生长表型。具体实施方式本专利技术结合附图和实施例作进一步的说明。以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种达巴万星前体A40926B0高产菌株，其特征在于，所述菌株为哥伦扎诺野野村菌，分类命名为：哥伦扎诺野野村菌L71(Nonomuraea gerenzanensis L71)，保藏号：CGMCCNo.21334，保藏日：2020年12月7日。/n

【技术特征摘要】
1.一种达巴万星前体A40926B0高产菌株，其特征在于，所述菌株为哥伦扎诺野野村菌，分类命名为：哥伦扎诺野野村菌L71(NonomuraeagerenzanensisL71)，保藏号：CGMCCNo.21334，保藏日：2020年12月7日。


2.权利要求1所述的一种达巴万星前体A40926B0高产菌株的构建方法，其特征在于，通过以下步骤实现：将A40926B0生物合成基因簇导入出发菌株哥伦扎诺野野村菌L70中，筛选得到的基因工程菌株哥伦扎诺野野村菌L71中，哥伦扎诺野野村菌L70保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCCNo.21333，分类命名：哥伦扎诺野野村菌(Nonomuraeagerenzanensis)。


3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)设计特异性引物以哥伦扎诺野野村菌L70基因组BAC文库为模板，扩增SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3，筛选包含完整A40926B0生物合成基因簇序列的单克隆菌落：上部筛选引物SEQIDNO.4：CGTTGAACTGGGTGGACATG，SEQIDNO.5：TGGGACCTGCTGGAGGAG内部筛选引物SEQIDNO.6：GCAACATGGTTGTCAGTCTG，SEQIDNO.7：CTCTCGGTAGAGATCCACTTC下部筛选引物SEQIDNO.8：GTAGTGGATGGCGAGCCAC，SEQIDNO.9：GCTGGTACGGGACAAGGTC；
(2)步骤(1)中筛选到的包含完整A40926B0生物合成基因簇表达载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：李永泉，夏天宇，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33