本发明专利技术涉及生物工程技术领域，本发明专利技术提供一株高山被孢霉(Mortierella alpina)菌株XY05201 CGMCC NO.20262，其所属物种为高山被孢霉(Mortierella alpina)，该菌株已于2020年8月27日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该菌株保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.20262，该保藏中心简称为CGMCC，该保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明专利技术提供的菌株XY05201具有生长迅速，易于培养，生产的多不饱和脂肪酸含量高，能生产大量的花生四烯酸。
【技术实现步骤摘要】
一株高山被孢霉菌株XY05201及其应用
本专利技术属于微生物工程发酵
技术介绍
多不饱和脂肪酸指含有两个或两个以上双键且碳链长度为18～22个碳原子的直链脂肪酸，这些脂肪酸在包括人在内的高等动物体内具有重要的生理功能，例如花生四烯酸(ARA)在大脑免受氧化应激和早期神经发育方面发挥重要作用[1]，同时也是一些重要物质的前体[2]，如：前列腺素，血栓烷，脂类毒素和白三烯等[2]。目前，多不饱和脂肪酸，尤其是C20系列，主要是通过深海鱼类中获得。近年来由于海洋资源的过度开发，越来越多的研究开始关注于利用微生物来生产多不饱和脂肪酸。高山被孢霉(Mortierellaalpina)是一种丝状真菌，但与其他丝状真菌相比，其能够大量合成长链多不饱和脂肪酸，尤其是二十碳三烯酸(DGLA)、二十碳四烯酸(ARA)和二十碳五烯酸(EPA)。但是由于高山被孢霉生长缓慢，而在低温下更适合生产多不饱和脂肪酸，因而有大量的研究聚焦于寻找优良菌株以提高产量[3]。
技术实现思路
本专利技术涉及生物工程
，提供一株用于生产多种不饱和脂肪酸的高山被孢霉(Mortierellaalpina)菌株XY05201，该菌株能够合成5种多不饱和脂肪酸，占总脂肪酸的75.5％，分别是亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)、二十碳三烯酸(C20:3)、二十碳四烯酸(C20:4)和二十碳五烯酸(C20:5)，且ARA的含量最高，占总脂的45.6％。本专利技术提供一株高山被孢霉(Mortierellaalpina)菌株XY05201，其所属物种为高山被孢霉(Mortierellaalpina)，该菌株已于2020年8月27日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该菌株保藏中心登记入册编号为CGMCCNO.20262，该保藏中心简称为CGMCC，该保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术提供的菌株XY05201具有生长迅速，易于培养，生产的多不饱和脂肪酸含量高，能生产大量的花生四烯酸。附图说明图1是气相质谱检测脂肪酸成分峰图。具体实施方式实施例11.菌种的采集、培养、鉴定菌株分离自土壤样品，2017年8月采集地点为中国西藏自治区察隅县，分离培养基是PDA(马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L)，培养温度为20℃。菌株进行活化之后，无菌水洗脱孢子，按照5％的接种量接种于Kendrick培养基[4](主要成分是50g/L葡萄糖,2g/L酒石酸胺,7.0g/LKH2P04,2.0g/LNa2HP04,1.5g/LMgS04·7H20,1.5g/L酵母粉,0.1g/LCaCl2.2H20,8mg/LFeCl3·6H20,1mg/LZnS04·7H20,0.1mg/LCuSO4·5H20,0.1mg/LCO(NO3)2·6H20and0.1mg/LMnS04·5H20,pH6.0。)中，然后在摇床中140rpm，20℃培养7天。菌种的鉴定：分子生物学鉴定，使用志昂生物试剂盒提取总DNA，之后使用特异性引物扩增序列片段，然后在华大基因进行Sanger测序,得到数据后进行BLAST，确定该菌种为高山被孢霉(Mortierellaalpina)，命名为菌株XY05201。分子生物学使用ITSrDNA序列，设计特异性引物如下：引物1：5'-GGCTTAATTTGACTCAACACGG-3'；引物2：5'-GCTATCCTGAGGGAAACTTCG-3'。ITSrDNA分子条形码序列如序列表1所示。高山被孢霉(Mortierellaalpina)菌株XY05201已于2020年8月27日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该菌株保藏中心登记入册编号为CGMCCNO.20262，该保藏中心简称为CGMCC，该保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.合成脂肪酸：菌株XY05201活化：无菌水洗脱孢子，按照5％的接种量接种于Kendrick培养基[4](主要成分是50g/L葡萄糖,2g/L酒石酸胺,7.0g/LKH2P04,2.0g/LNa2HP04,1.5g/LMgS04·7H20,1.5g/L酵母粉,0.1g/LCaCl2.2H20,8mg/LFeCl3·6H20,1mg/LZnS04·7H20,0.1mg/LCuSO4·5H20,0.1mg/LCO(NO3)2·6H20and0.1mg/LMnS04·5H20,pH6.0。)中，然后在摇床中140r/min，20℃条件下培养7天，得培养基发酵液。培养完成后，将培养基发酵液进行真空抽滤得到鲜菌体，取出100mg采用气相质谱联用的方法对脂肪酸成分进行鉴定，如下表所示。表：菌种XY05201脂肪酸成分表脂肪酸成分C14:0C16:0C18:3C18:2C18:1C18:0C20:4C20:5C20:3Others含量占比(％)3.2211.968.7815.415.982.5445.572.393.400.76微生物油脂的提取：将上述培养基发酵液抽滤得到鲜菌体，之后使用烘箱70℃干燥至恒重，得到干菌体。取1g干菌体加入6M盐酸5mL，之后沸水浴30min，冷却后加入95％乙醇10mL，之后再加入石油醚和乙醚各5mL，震荡均匀后，5000rpm离心3min，最后蒸发萃取剂得到微生物油脂。气相色谱样品制备：称取100mg从培养基发酵液中获得的菌株XY05201的鲜菌体，置于5mL的螺口玻璃管中。向样品管中加入1mL试剂I(皂化试剂SaponificationReagent：150mL去离子水、150mL甲醇、45gNaOH)，拧紧螺盖，沸水浴5min，取出观察试管是否漏气，如有漏气，将样品冷却到室温，转移到新的试管，重新沸水浴5min测试，如无漏气现象，将试管震荡5–10s，继续沸水浴25min，取出试管，用流水冲洗试管壁使其冷却。将冷却的试管打开，加入2mL试剂II(甲基化试剂MethylationReagent：325mL6mol·L-1HCl、275mL甲醇)，拧紧盖子，震荡5–10s,迅速放入设定为80℃的水浴锅中加热10min，取出试管用流水快速冷却至室温。向冷却后的试管中加入1.25mL试剂III(萃取试剂ExtractionSolvent：200mL甲基叔丁基醚(MTBE)、200mL正己烷)，拧紧螺盖，将试管放在摇床上温和摇晃10min，用干净的巴斯德吸管将每个试管中的下层水相丢弃。向样品中加入3mL试剂IV(洗涤试剂BaseWash：10.8gNaOH、900mL去离子水)，拧紧螺盖，将试管放在摇床上温和本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株高山被孢霉(Mortierella alpina)菌株XY05201 CGMCC NO.20262。/n
【技术特征摘要】
1.一株高山被孢霉(Mortierellaalpina)菌株XY05201CGMCCNO.20262。
2.高山被孢霉(Mortierellaalpina)菌株XY...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘小勇，赵恒，刘晓玲，王亚宁，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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