一种月柿离体再生体系建立方法技术

本发明专利技术公开了一种月柿离体再生体系建立方法，涉及植物培育技术领域，其技术方案要点是：初代培养接种到DKW+ZT 0.5～3.0mg/L的基本培养基中培养20～30d；继代培养接种到DKW+ZT 0.5～3.0mg/L+IAA 0.05～0.5mg/L的基本培养基中进行培养；愈伤组织诱导接种在1/2DWK+ZT 0.5～3.0mg/L+TDZ 0.25～2.0mg/L的基本培养基中暗培养20～35d后，光下诱导愈伤组织和不定芽的形成；不定芽再生接种在1/2DKW+ZT 0.5～4.0mg/L分化培养25～40d；接种在1/2DKW+IAA 0.5～4.0mg/L的基本培养基中，暗培养5～10d后，再光下培养20～35d。本发明专利技术能够高效、稳定的完成月柿离体再生培养，繁殖率高、质量高、培养时间短，为通过基因工程进行涩柿遗传改良奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种月柿离体再生体系建立方法
本专利技术涉及植物培育
，更具体地说，它涉及一种月柿离体再生体系建立方法。
技术介绍
柿隶属于柿科(Ebenaceae)柿属(DiospyrosLinn.)，作为果树栽培的代表种，在我国栽培已有2000年以上的历史。柿子富含营养，鲜果色泽艳丽，味道甜美，营养成分丰富，柿果也极易于加工，可以用于做柿饼、柿干、柿茶、柿醋和柿酒。还可替代粮食，与栗、枣齐名，素有“铁杆庄稼”、“木本粮食”的美誉。柿子的多种成分可以入药，包括柿霜，柿蒂，柿根，柿叶，可以用于解酒降压。近些年来，美国、澳大利亚、巴西、智利、新西兰等国家也开始大量栽培柿子。据联合国粮农组织2013年统计，2012年我国柿的总产量为3386000吨，占世界总产量的76.05％，2012年我国柿的总种植面积为734800公顷，占世界栽培总面积的90.13％，无论是柿产量还是种植面积，我国都居世界首位。涩柿果实成熟后需进行人工脱涩才能食用，且很多时候脱涩不完全，食用后果肉中残存的可溶性单宁会与胃粘膜蛋白结合，形成“胃柿石”；而完全甜柿果实成熟后不需人工脱涩即可脆食，果实货架期长，因而更具商品价值，是柿育种的终极目标。目前，我国柿栽培品种绝大多数为完全涩柿，如月柿、磨盘柿和富平尖柿等已经占有较大的市场份额，但每年的采后人工脱涩耗费大量的人力物力，增加了生产成本，这大大阻碍了我国柿产业的发展。因此，利用植物基因工程技术，在保持其他优良性状的前提下对涩柿进行“甜柿化”遗传改造，将大大加快我国完全甜柿育种进程，促进我国柿产业的发展。<br>目前，第一方面，对于柿的初代培养，多数研究在取材时为避免内生菌的污染而往往会选取当年抽生的嫩枝，一般长3～5cm，研究发现过小的茎段在灭菌时极易被杀死，同时茎段过短，节间距小，芽密集，不利于茎段上芽的萌发生长。第二方面，不同植物生长调节剂及、浓度对柿的初代培养影响较大，其中BA和ZT最为常见，已有研究表明许多柿树品种植物在含BA的培养基中不能正常生长，BA能诱发多酚氧化酶活性，极易导致初代苗基部褐化，而增加死亡率。第三方面，月柿组培苗在MS(1/2N)基本培养基早期继代生长良好，随着继代次数的增加，组培苗开始普遍存在茎段生长而不长叶片的现象，叶片小且玻璃化，大部分叶片成簇生状。第四方面，已有研究表明月柿继代培养中ZT浓度过高极易导致茎基部愈伤组织的形成和过度生长，进而抑制腋芽的萌发抽生以及阻碍叶片的生长。综上，现有的柿初代培养、继代培养存在较多的限制，无法直接应用到通过植物基因工程技术在保持其他优良性状的前提下对涩柿进行遗传改造过程中。因此，如何研究设计一种高效、稳定的月柿离体再生体系建立方法是我们目前急需解决的问题，为通过基因工程进行涩柿遗传改良奠定了基础。
技术实现思路
为解决现有技术中的不足，本专利技术的目的是提供一种月柿离体再生体系建立方法。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种月柿离体再生体系建立方法，包括以下步骤：S101，初代培养：将清洗后的嫩茎切割成各含2个腋芽的茎段，最后接种到DKW+ZT0.5～3.0mg/L的基本培养基中培养20～30d；S102，继代培养：将初代培养获得的无菌组培苗切成含有1-2个腋芽长约1cm的茎段，然后接种到DKW+ZT0.5～3.0mg/L+IAA0.05～0.5mg/L的基本培养基中进行培养；S103，愈伤组织诱导：以继代培养20～35d苗龄的月柿组培苗叶片为外植体，从叶中部横切一刀分成叶柄部和叶尖部两块，叶背朝上，接种在1/2DWK+ZT0.5～3.0mg/L+TDZ0.25～2.0mg/L的基本培养基中暗培养20～35d后，光下诱导愈伤组织和不定芽的形成；S104，不定芽再生：愈伤组织诱导暗培养20～35d，后接种在1/2DKW+ZT0.5～4.0mg/L分化培养25～40d，诱导不定芽再生；S105，生根培养：取月柿再生组培苗茎段，接种在1/2DKW+IAA0.5～4.0mg/L的基本培养基中，暗培养5～10d后，再光下培养20～35d。进一步的，所述初代培养中的嫩茎处理具体为：取月柿当年抽生长约5cm的嫩茎，将嫩茎上的叶片留叶柄去掉叶片，用流水冲洗30～60min，于超净工作台中将茎段放入已经灭菌好的锥形瓶中；用75％的酒精进行表面灭菌30s，再用2％的NaClO浸泡3～8min，浸泡过程要不断的摇动，最后用无菌水冲洗3～6次。进一步的，所述基本培养基中均包括：蔗糖28～32.0mg/L，琼脂6.0～8.0mg/L，PVP-K400.5～4.0mg/L，pH值为5.8～6.0。进一步的，所述基本培养基配制好后，于121℃高温灭菌15min，然后置于超净工作台中冷却至55℃左右，最后加入过滤灭菌的植物生长调节剂，摇匀后分装至培养瓶中备用。进一步的，所述1/2DKW培养基是DKW培养基的大量元素﹑微量元素﹑有机物和铁盐含量均减半。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术选取当年生长度约10cm的未木质化的枝条，先用无菌水冲洗，再用75％乙醇灭菌30S，2％次氯酸钠灭菌5min，最后用灭菌水清洗5次，即可有效灭菌消毒又可以极大避免茎段及幼芽被灭菌杀死，芽的萌发率也较高，易长出健壮的新梢；2、本专利技术能够快速的诱导不定芽的分化，再生率显著提高，且分化形成的不定芽极易抽生长大；3、本专利技术接种1/2DKW基本培养基上的月柿叶片愈伤组织形成率更高，且愈伤组织紧实淡绿，生长较大，二次诱导后不定芽再生率显著高于MS(1/2N)基本培养基，不定芽数量多；4、本专利技术通过暗培养对月柿叶片愈伤的诱导效果十分明显，有利于加快愈伤组织的形成和减少愈伤组织的褐化。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例中基本培养基和ZT对月柿初代培养影响对比图；图2是本专利技术实施例中月柿初代培养情况结果图；图3是本专利技术实施例中基本培养基和ZT浓度对月柿继代培养的影响对比图；图4是本专利技术实施例中月柿继代培养情况结果图；图5是本专利技术实施例中基本培养基、ZT、TDZ、IAA对离体叶片愈伤组织形成和不定芽再生的影响对比图；图6是本专利技术实施例中离体叶片愈伤组织形成结果图；图7是本专利技术实施例中不定芽再生结果图；图8是本专利技术实施例中生根培养结果图。具体实施方式为了使本专利技术所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。实施例1(一)初代培养体系的建立取月柿当年抽生长约5cm的嫩茎，将嫩茎上的叶片留叶柄去掉叶片，用流水冲洗6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种月柿离体再生体系建立方法，其特征是，包括以下步骤：/nS101，初代培养：/n将清洗后的嫩茎切割成各含2个腋芽的茎段，最后接种到DKW+ZT 0.5～3.0mg/L的基本培养基中培养20～30d；/nS102，继代培养：/n将初代培养获得的无菌组培苗切成含有1-2个腋芽长约1cm的茎段，然后接种到DKW+ZT0.5～3.0mg/L+IAA 0.05～0.5mg/L的基本培养基中进行培养；/nS103，愈伤组织诱导：/n以继代培养20～35d苗龄的月柿组培苗叶片为外植体，从叶中部横切一刀分成叶柄部和叶尖部两块，叶背朝上，接种在1/2DWK+ZT 0.5～3.0mg/L+TDZ 0.25～2.0mg/L的基本培养基中暗培养20～35d后，光下诱导愈伤组织和不定芽的形成；/nS104，不定芽再生：/n愈伤组织诱导暗培养20～35d，后接种在1/2DKW+ZT 0.5～4.0mg/L分化培养25～40d，诱导不定芽再生；/nS105，生根培养：/n取月柿再生组培苗茎段，接种在1/2DKW+IAA 0.5～4.0mg/L的基本培养基中，暗培养5～10d后，再光下培养20～35d。/n

【技术特征摘要】
1.一种月柿离体再生体系建立方法，其特征是，包括以下步骤：
S101，初代培养：
将清洗后的嫩茎切割成各含2个腋芽的茎段，最后接种到DKW+ZT0.5～3.0mg/L的基本培养基中培养20～30d；
S102，继代培养：
将初代培养获得的无菌组培苗切成含有1-2个腋芽长约1cm的茎段，然后接种到DKW+ZT0.5～3.0mg/L+IAA0.05～0.5mg/L的基本培养基中进行培养；
S103，愈伤组织诱导：
以继代培养20～35d苗龄的月柿组培苗叶片为外植体，从叶中部横切一刀分成叶柄部和叶尖部两块，叶背朝上，接种在1/2DWK+ZT0.5～3.0mg/L+TDZ0.25～2.0mg/L的基本培养基中暗培养20～35d后，光下诱导愈伤组织和不定芽的形成；
S104，不定芽再生：
愈伤组织诱导暗培养20～35d，后接种在1/2DKW+ZT0.5～4.0mg/L分化培养25～40d，诱导不定芽再生；
S105，生根培养：
取月柿再生组培苗茎段，接种在1/2DKW+IAA0.5～4.0mg/L的基本培养基中，暗培养5～10d后，再光下培养20～35d。

【专利技术属性】
技术研发人员：杜晓云，莫荣利，王彦波，张娜，于晓丽，赵玲玲，慈志娟，牟红梅，张硕，
申请(专利权)人：山东省烟台市农业科学研究院，湖北省农业科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37