一种用于检测小鼠动情期的细胞标记分子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测小鼠动情期的细胞标记分子及其应用，所述细胞标记分子为Slit2蛋白或Txnip蛋白。本发明专利技术筛选出小鼠动情期的细胞标记分子为Slit2、Txnip，可用于鉴定小鼠是否处于动情期，也可用于诱发小鼠发情或超数排卵处理。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测小鼠动情期的细胞标记分子及其应用(一)
本专利技术涉及一种用于检测小鼠动情期的细胞标记分子及其应用。(二)
技术介绍
哺乳类的雌性动物在性成熟后，卵巢发生周期性变化：卵泡发育、排卵、黄体和与之相应的卵巢激素发生周期性的变化。在激素的作用下，子宫及阴道粘膜发生周期性的变化。这种周期性的变化被称为动情周期。小鼠的发情周期一般为5～6d，自初情期之后，如果没有配种或配种后没有怀孕，则每间隔一段时间便开始下一次发情，周而复始，循环往复。根据雌性动物的生理变化，可将动情周期划分为四个时期：(1)动情前期，此时卵巢上的黄体已退化或萎缩、卵泡开始发育，孕激素水平逐渐降低，雌激素分泌增加，在雌激素作用下，子宫内膜基底层细胞开始增生，腺体增多变宽；(2)动情期，是指有明显发情症状的时期。此时卵巢上的卵泡迅速发育，黄体分泌的雌激素逐渐增加到最高水平，孕激素逐渐降到最低水平；子宫内膜继续增厚，子宫肌层收缩加强、腺体进一步扩大；阴道上皮逐渐角质化、并有鳞片细胞脱落(无核上皮细胞)。(3)动情后期，发情症状逐渐消失的时期。此时卵巢上的卵泡破裂、排卵，并开始形成新的黄体，孕激素分泌逐渐增加；子宫肌层收缩和腺体分泌活动均减弱，黏液分泌量减少而变黏稠；阴道表层上皮脱落，释放一些白细胞至黏液中。(4)动情间期，开始时，卵巢上的黄体逐渐生长，子宫腺体高度发育，大而弯曲，且分支多，分泌活动旺盛。随后，增厚的子宫内膜回缩，呈矮柱状，腺体变小，分泌活动停止，并开始萎缩，孕激素分泌量逐渐减少。目前检测小鼠动情周期的方法主要为宫颈黏液结晶法、阴道脱落细胞法、角化细胞计数法。运用宫颈黏液结晶法时，从形态学上判断，缺乏完全客观的标准，只能作为大体上判断动情期的方法，若月经不调，非动情期也可出现假阳性现象。阴道脱落细胞法也是从主观上判断，缺乏完全客观的标准，同样只能作为大体上判断动情期的方法，较适宜于动态观察，且遇阴道感染时，亦可见大量白细胞，难以与动情间期的白细胞为主的情况相区别，出现假阴性现象。角化细胞计数法实际上是阴道脱落细胞法演变而来，用此法有一定的客观判断标准。到目前为止对于小鼠动情周期的检测仅局限于这几种方法，尚缺乏针对动情周期中各个时期特异性的细胞标记分子，小鼠动情期无法得到准确的判断。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种检测小鼠动情期的细胞标记分子，并采用这种标记分子特异性地鉴定小鼠是否处于动情期；本专利技术通过取小鼠动情周期中不同时期即动情前期、动情期、动情后期和动情间期的子宫，分别进行蛋白质组学和转录组学分析，通过蛋白质组学和转录组学联合分析筛选出动情期期特异的细胞标记分子，解决小鼠动情期无法得到准确判断的问题。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种用于检测小鼠动情期的细胞标记分子，所述细胞标记分子为Slit2蛋白或Txnip蛋白，其中Slit2蛋白编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，Txnip蛋白编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供一种所述细胞标记分子在制备小鼠动情期检测剂中的应用，所述应用是以待测样品cDNA为模板，通过Slit2蛋白引物或Txnip蛋白引物，采用RT-PCR方法检测待测样品，若Slit2蛋白或Txnip蛋白的表达，即为动情期，若非动情期几乎不表达。进一步，所述PCR反应体系为：cDNA1μL、10μM的上下游引物各0.2μL、2XPCRMix5μL，加ddH2O补至总体积10μL。Slit2蛋白检测PCR程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35循环，4℃，循环数38。Txnip蛋白检测PCR程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，35循环，4℃，循环数38。进一步，所述待测样品是用枪头吸取少量生理盐水在小鼠的阴道反复来回冲洗几次，再吸回枪头，即为阴道脱落细胞。进一步，所述Txnip蛋白检测引物如下：Txnip引物F:GGCCGGACGGGTAATAGTG；Txnip引物R:AGCGCAAGTAGTCCAAAGTCT；进一步，所述Slit2蛋白检测引物如下：Slit2引物F:GGCAGACACTGTCCCTATCG；Slit2引物R:GTGTTGCGGGGGATATTCCT。本专利技术提供的细胞标记分子在小鼠动情期是特异表达的，可应用于小鼠动情期的鉴定，也可用于诱发小鼠发情或超数排卵处理。与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术筛选出小鼠动情期的细胞标记分子为Slit2、Txnip，可用于鉴定小鼠是否处于动情期，也可用于诱发小鼠发情或超数排卵处理。(四)附图说明图1小鼠阴道涂片显微图小鼠分别处于动情前期、动情期、动情后期及动情间期时的阴道涂片的显微照片(放大10倍)。图2动情期和其它时期蛋白质组和转录组的差异蛋白质(基因)的GO富集结果绘制成GO功能富集聚类热图；图中红色代表上调，蓝色代表下调，横向聚类为蛋白质在蛋白质组和转录组层面的表达情况的聚类，即一个cluster中蛋白质(基因)的表达模式类似。图3琼脂糖进行凝胶电泳图，四个泳道代表随机选择四只小鼠。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1、检测小鼠动情期的细胞标记分子筛选1、小鼠动情时期的检测实验采用6-8周龄C57BL/6小鼠，饲养于光控(12h/d，8：00～20：00)和温控[(22±1)℃]的环境。动物可以自由饮水和采食。通过阴道脱落细胞法，即暴露小鼠阴道后，用吸取少许生理盐水的枪头在阴道侧壁上1/3处轻轻吸取分泌物，薄而均匀涂于玻片上，95％乙醇固定后经苏木素染色于显微镜下观察。每日晨涂片，连续观察7d。小鼠的动情周期各个时期的阴道图片如图1中所示，动情前期多为有核上皮细胞，偶有少量无核角化细胞；动情期多为无核角化细胞，偶有少量有核上皮细胞；动情后期则白细胞、有核上皮细胞和无核角化细胞，三者均有；动情间期多为白细胞，偶有少量上皮细胞。2、小鼠子宫的分离实验采用6-8周龄C57BL/6J小鼠，饲养于光控(12h/d，8：00～20：00)和温控[(22±1)℃]的环境。动物可以自由饮水和采食。适应饲养1周后，颈椎脱臼处死，用75％酒精消毒腹部，打开腹腔取双侧子宫，分为蛋白质组和转录组。蛋白质组用预冷的生理盐水/PBS稍漂洗，转录组用RNasefree水稍漂洗，以去除血渍和污物，置于EP管中并做好标记，液氮速冻5min以上，保存至-80℃，避免反复冻融。3、小鼠子宫TMT定量蛋白质组和转录组检测分析将步骤2收集好的样本干冰寄送至公司，分别进行TMT定量蛋白质组检测和转录组学测序分析。根据关联分析结果，如图2所示，筛选出在动情期表达高(低)而在其它三个时期表达低(高)的基因Slit2、Txnip，作为此时期的细胞标记本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测小鼠动情期的细胞标记分子，其特征在于所述细胞标记分子为Slit2蛋白或Txnip蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测小鼠动情期的细胞标记分子，其特征在于所述细胞标记分子为Slit2蛋白或Txnip蛋白。


2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述Slit2蛋白编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，Txnip蛋白编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。


3.一种权利要求1所述细胞标记分子在制备小鼠动情期检测剂中的应用。


4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用是以待测样品cDNA为模板，通过Slit2蛋白引物或Txnip蛋白引物，采用RT-PCR方法检测待测样品进行检测，若Slit2蛋白或Txnip蛋白表达，即为动情期。


5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述PCR反应体系为：cDNA1μL、10μM的上下游引物各0.2μL、2XPCRMix5μL，加ddH2O补至总体积10μL。


6.如权利要求4所述的应用，其特征在于Slit2...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈烨，胡晓佳，王志强，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33