基于SNP分子标记鉴定马苏金枪鱼的引物、方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供基于SNP分子标记鉴定马苏金枪鱼的成套引物，其包括基于马苏金枪鱼的物种特异性SNP分子标记而设计的一对PCR扩增引物和一条探针。该SNP分子标记包括位于SEQ ID No.1所示序列中第255位的C碱基，一对PCR扩增引物中上游引物的序列是或包含5’‑CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT‑3’，下游引物的序列是或包含5’‑GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT‑3’，探针是序列为5’‑TTTCATTCTGCCACTGTG‑3’的普通探针或者序列为5’‑cattctg(C)ca‑3’的循环探针，探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

【技术实现步骤摘要】
基于SNP分子标记鉴定马苏金枪鱼的引物、方法和试剂盒
本专利技术属于水产品物种鉴别、检测的
，具体涉及基于物种特异性的SNP分子标记鉴定马苏金枪鱼的引物、方法和试剂盒。
技术介绍
金枪鱼具有很高的的经济价值，是世界上高档的水产品之一。在国内金枪鱼的主要销售形式为生鱼片、寿司和罐头，金枪鱼及制品的销售量从几吨上升到了几万吨，高档金枪鱼甚至占市场份额的60％以上。不同品种金枪鱼价格差异很大，加之其体型较大，多采用去头去皮后分割销售的方式，使得一般消费者很难区分这种缺失了典型外形特征的产品，导致金枪鱼市场上标签错乱和以次充好的问题尤为严重。马苏金枪鱼被世界自然保护联盟红色名录列为极度濒危等级，虽然已经开始进行人工养殖，但其自然群体资源已处于过度捕捞状态。马苏金枪鱼是一个重要的商业物种，该物种在生鱼片市场非常珍贵，寿司店常用高品质的含脂肪的该种鱼作高档寿司。鲜活的马苏金枪鱼具有鲜明和完整的外部形态学特征，可采用形态学鉴定方法进行鉴别，但是针对生鱼片或者经深加工工艺处理过的鱼类产品如罐头等，原本的形态学特征和蛋白质伴随加工过程的进行而逐渐流失或变性，由于缺乏外部形态学特征，不易鉴定其真伪，不法商家以次充好，甚至通过染色的方式，以低价值的其他金枪鱼生鱼片冒充高价值的马苏金枪鱼，获取暴利，扰乱了市场秩序，破坏了商业诚信，损害了消费者利益，马苏金枪鱼鉴别方法成为金枪鱼行业的迫切需求。另一方面，国际组织开展非法捕捞的打击活动、濒危物种的保护活动，也需要快速、准确鉴别马苏金枪鱼物种。因此，快速、准确地鉴定马苏金枪鱼及其制品的试剂和方法已成为国内外研究的热点。
技术实现思路
本专利技术的目的一方面在于提供基于SNP分子标记用于鉴定马苏金枪鱼的成套引物，所述成套引物包括基于所述SNP分子标记而设计的一对PCR扩增引物和一条探针。优选地，所述SNP分子标记包括位于SEQIDNo.1所示序列中第255位的C碱基。优选地，所述一对扩增引物中的上游引物的序列是或包含5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列是或包含5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，所述探针的序列是5’-TTTCATTCTGCCACTGTG-3’，5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团MGB(MinorGrooveBinder，小沟结合物)。优选地，所述一对扩增引物中的上游引物的序列是或包含5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列是或包含5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，所述探针是循环探针，其序列是5’-cattctg(C)ca)-3’，5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团Eclipse。另一方面，本专利技术还提供一种基于SNP分子标记鉴定马苏金枪鱼的方法，所述SNP分子标记包括位于SEQIDNo.1所示序列中第255位的C碱基，所述方法包括以下步骤：(I)基于所述SNP分子标记设计一对PCR扩增引物和一条探针；(II)从待鉴定对象的肌肉组织中提取DNA；(III)利用所述一对PCR扩增引物和所述探针，以步骤(II)中所提取的DNA为模板进行实时荧光PCR反应。优选地，所述一对PCR扩增引物中的上游引物的序列是或包含5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列是或包含5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，所述探针的序列是5’-TTTCATTCTGCCACTGTG-3’，5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。在步骤(III)中，利用所述一对PCR扩增引物和所述探针进行实时荧光PCR反应。优选地，所述成套引物包括一对PCR扩增引物和一条循环探针，所述一对PCR扩增引物中的上游引物的序列是或包含5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列是或包含5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，所述循环探针的序列是5’-cattctg(C)ca-3’，5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团Eclipse。在步骤(III)中，利用所述一对PCR扩增引物和所述循环探针进行实时荧光PCR反应。另一方面，本专利技术还提供用于鉴定马苏金枪鱼的试剂盒，其包含基于SNP分子标记而设计的成套引物，所述SNP分子标记包括位于SEQIDNo.1所示序列中第255位的C。优选地，所述成套引物包括一对PCR扩增引物和一条探针，所述一对PCR扩增引物中上游引物的序列是或包含5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列是或包含5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，所述探针的序列是5’-TTTCATTCTGCCACTGTG-3’，5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。优选地，所述成套引物包括一对PCR扩增引物和一条循环探针，所述一对PCR扩增引物中的上游引物的序列是或包含5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物是或包含序列5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，所述循环探针是5’-cattctg(C)ca-3’，5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团Eclipse。优选地，所述试剂盒还包括作为阳性质控品的马苏金枪鱼肌肉组织冻干粉或基因组DNA、作为阴性质控品的草鱼肌肉组织冻干粉或基因组DNA、实时荧光PCR反应所需的其他试剂。附图说明图1是示出本专利技术实施例1中利用基于SNP位点设计的成套引物，以马苏金枪鱼基因组DNA为模板进行实时荧光PCR反应时的结果图。图2是实施例2中对利用实施例1的实时荧光PCR法检测时的灵敏度进行分析的结果图，图中标注为10、0.1、0.01和0.001的曲线分别是模板DNA浓度为10ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL和0.001ng/μL时的扩增曲线。图3是示出实施例3中利用基于SNP位点设计的成套引物，以马苏金枪鱼基因组DNA为模板进行实时荧光PCR反应时的结果图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本专利技术中利用2b-RAD的测序分析结果，针对马苏金枪鱼(Thunnusmaccoyii)，以蓝鳍金枪鱼(Thunnusthynnus)、黄鳍金枪鱼(Thunnusalbacares)、大目金枪鱼(Thunnusobesus)和长鳍金枪鱼(Thunnusalalunga)等金枪鱼为参照，筛选马苏金枪鱼物种特异性的SNP位点。将初步筛选到的SNP位点按照品种特异标记界定标准进行二次筛选：(1)同一位点本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于SNP分子标记鉴定马苏金枪鱼的成套引物，其特征在于：/n所述成套引物包括基于所述马苏金枪鱼的物种特异性SNP分子标记而设计的一对PCR扩增引物和一条探针。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于SNP分子标记鉴定马苏金枪鱼的成套引物，其特征在于：
所述成套引物包括基于所述马苏金枪鱼的物种特异性SNP分子标记而设计的一对PCR扩增引物和一条探针。


2.根据权利要求1所述的成套引物，其特征在于：
所述SNP分子标记包括位于SEQIDNo.1所示序列中第255位的C碱基。


3.根据权利要求2所述的成套引物，其特征在于：
所述一对扩增引物中的上游引物的序列是或包含5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列是或包含5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，
所述探针的序列是5’-TTTCATTCTGCCACTGTG-3’，所述探针的5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。


4.根据权利要求2所述的成套引物，其特征在于：
所述一对PCR扩增引物中的上游引物的序列是或包含5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列是或包含5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，
所述探针是循环探针，其序列是5’-cattctg(C)ca-3’，所述循环探针的5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团Eclipse。


5.一种基于SNP分子标记鉴定马苏金枪鱼的方法，其特征在于：
所述SNP分子标记包括位于SEQIDNo.1所示序列中第255位的C碱基，
所述方法包括以下步骤：
(I)基于所述SNP分子标记设计一对PCR扩增引物和一条探针；
(II)从待鉴定对象的肌肉组织中提取DNA；
(III)利用所述一对PCR扩增引物和所述探针，以步骤(II)中所提取的DNA为模板进行实时荧光PCR反应。


6.根据权利要求5所述的基于SNP分子标记鉴定马苏金枪鱼的方法，其特征在于：
所述一对PCR扩增引物中的上游引物的序列是或包含5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列是或包含5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-...

【专利技术属性】
技术研发人员：王联珠，郭莹莹，姚琳，江艳华，曲梦，李娜，李风铃，谭志军，卢立娜，柳淑芳，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37