一种从胚胎干细胞分化获得肺上皮细胞的方法及其使用的培养基技术

本发明专利技术公开了一种从胚胎干细胞分化获得肺上皮细胞的方法及其使用的培养基。实验证明，本发明专利技术提供的方法可以将胚胎干细胞分化为肺上皮细胞，质量稳定，安全性高，为组织工程、药物开发和细胞治疗提供大量的细胞来源；SARS‑CoV‑2假病毒和穿山甲冠状病毒GX_P2V可以高效感染该肺上皮细胞。由此可见，本发明专利技术提供的方法制备的肺上皮细胞可以作为细胞模型筛选抑制病毒药物。本发明专利技术具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种从胚胎干细胞分化获得肺上皮细胞的方法及其使用的培养基
本专利技术属于生物
，具体涉及一种从胚胎干细胞分化获得肺上皮细胞的方法及其使用的培养基。
技术介绍
高致病性冠状病毒感染一直是重大的公共卫生问题。近年来爆发流行的严重急性呼吸综合征(SARS)、中东呼吸综合征(MERS)以及新冠肺炎(COVID-19)，对全人类的生命健康和经济发展带来了严重的影响。制备肺上皮细胞感染模型对新型冠状病毒的基础研究、疫苗研究及药物筛选等是非常必要的。目前研究应用的细胞模型为来源于绿猴肾脏的VeroE6细胞，其模拟病毒感染肺上皮细胞过程与临床结果略有差别，例如氯喹在VeroE6细胞模型上可以明显抑制新型冠状病毒复制，但在肺上皮细胞中抑制作用缺失。由此可见，不同来源的细胞模型对于病毒研究影响较大。另外，肺癌细胞系(如A549)也由于其为癌细胞而限制了其应用。原代肺上皮细胞可以很好地用来研究新型冠状病毒感染，但是其来源受限且不同人来源的细胞差异较大，还不能很好应用于研究中。干细胞分化技术的发展，为解决之前各种细胞系的缺陷提供了基础。首先，干细胞分化得到的细胞来源于人，具有种属特异性；其次，分化得到的细胞比较稳定，可以扩增，保证了大规模高通量筛选的细胞来源。因此，建立体外分化获得肺上皮细胞的方法，进而制备新型冠状病毒(即SARS-CoV-2)感染的细胞模型具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立体外分化获得肺上皮细胞的方法，从而制备病毒(如SARS-CoV-2、穿山甲冠状病毒GX_P2V)感染的细胞模型。本专利技术首先保护一种从前肠内胚层细胞分化产生肺上皮细胞的方法，可包括如下步骤：(a4)将前肠内胚层细胞接种至分化培养基I，培养8-12天(如8-10天、10-12天、8天、10天或12天)；所述分化培养基I可为在基础培养基中加入CHIR99021、BMP4、视黄醇、FGF10和FGF7后得到的培养基；(a5)完成步骤(a4)后，将所述细胞接种至分化培养基II，继续培养，直至获得肺上皮细胞；所述分化培养基II可为在基础培养基中加入CHIR99021、IBMX、地塞米松、FGF10和FGF7后得到的培养基。本专利技术还保护一种从内胚层细胞分化产生肺上皮细胞的方法，可包括如下步骤：(a2)将内胚层细胞接种至分化培养基A，培养1-2天(如1天或2天)；所述分化培养基A可为在基础培养基中加入Dorsomorphin和SB431542后得到的培养基；(a3)完成步骤(a2)后，将所述细胞接种至分化培养基B，培养1-3天(如1天、2天或3天)，得到前肠内胚层细胞；所述分化培养基B可为在基础培养基中加入IWP2和SB431542后得到的培养基；(a4)完成步骤(a3)后，将前肠内胚层细胞接种至分化培养基I，培养8-12天(如8-10天、10-12天、8天、10天或12天)；所述分化培养基I可为在基础培养基中加入CHIR99021、BMP4、视黄醇、FGF10和FGF7后得到的培养基；(a5)完成步骤(a4)后，将所述细胞接种至分化培养基II，继续培养，直至获得肺上皮细胞；所述分化培养基II可为在基础培养基中加入CHIR99021、IBMX、地塞米松、FGF10和FGF7后得到的培养基。本专利技术还保护一种从胚胎干细胞分化产生肺上皮细胞的方法，包括如下步骤：(a1)取胚胎干细胞，分化，获得内胚层细胞；(a2)完成步骤(a1)后，将内胚层细胞接种至分化培养基A，培养1-2天(如1天或2天)；所述分化培养基A可为在基础培养基中加入Dorsomorphin和SB431542后得到的培养基；(a3)完成步骤(a2)后，将所述细胞接种至分化培养基B，培养1-3天(如1天、2天或3天)，得到前肠内胚层细胞；所述分化培养基B可为在基础培养基中加入IWP2和SB431542后得到的培养基；(a4)完成步骤(a3)后，将前肠内胚层细胞接种至分化培养基I，培养8-12天(如8-10天、10-12天、8天、10天或12天)；所述分化培养基I可为在基础培养基中加入CHIR99021、BMP4、视黄醇、FGF10和FGF7后得到的培养基；(a5)完成步骤(a4)后，将所述细胞接种至分化培养基II，继续培养，直至获得肺上皮细胞；所述分化培养基II可为在基础培养基中加入CHIR99021、IBMX、地塞米松、FGF10和FGF7后得到的培养基。所述步骤(a1)中，“胚胎干细胞，分化，获得内胚层细胞”可为取胚胎干细胞，采用STEMdiffDefinitiveEndodermKit培养，获得内胚层细胞。所述培养方法参照如下文献：WuX，DaoThiVL，HuangY，etal.IntrinsicImmunityShapesViralResistanceofStemCells.Cell.2018；172(3)：423-438.e25.doi:10.1016/j.cell.2017.11.018。上述任一所述的方法中，所述基础培养基可包括DMEM/F12、IMDM、N2supplement(100×)、B27(100×)、维生素C、谷氨酰胺、硫代甘油和牛白蛋白。上述任一所述基础培养基的溶质及其浓度为(1-2)×N2supplement(如1×N2supplement或2×N2supplement)、(1-2)×B27(如1×B27或2×B27)、40-100ng/ml(如40-50ng/ml、50-100ng/ml、40ng/ml、50ng/ml或100ng/ml)维生素C、1-5mM(如1-2mM、2-5mM、1mM、2mM或5mM)谷氨酰胺、0.1-1.0μM(如0.1-0.2μM、0.2-1.0μM、0.1μM、0.2μM或1.0μM)硫代甘油和0.01-0.1％(如0.01-0.05％、0.05-0.1％、0.01％、0.05％或0.1％)(m/v)牛白蛋白；溶剂为40-60％(如40-50％、50-60％、40％、50％或60％)(v/v)的DMEM/F12和40-60％(如40-50％、50-60％、40％、50％或60％)(v/v)的IMDM。上述任一所述分化培养基I中，CHIR99021的浓度可为1-10μM(如1-3μM、3-10μM、1μM、3μM或10μM)。BMP4的浓度可为5-15ng/ml(如5-10ng/ml、10-15ng/ml、5ng/ml、10ng/ml或15ng/ml)。视黄醇的浓度可为1-10μM(如1-5μM、5-10μM、1μM、5μM或10μM)。FGF10的浓度可为10-25ng/ml(如10-20ng/ml、20-25ng/ml、10ng/ml、20ng/ml或25ng/ml)。FGF7的浓度可为5-20ng/ml(如5-10ng/ml、10-20ng/ml、5ng/ml、10ng/ml或20ng/ml)。...

【技术保护点】
1.一种从前肠内胚层细胞分化产生肺上皮细胞的方法，包括如下步骤：/n(a4)将前肠内胚层细胞接种至分化培养基I，培养8-12天；/n所述分化培养基I为在基础培养基中加入CHIR99021、BMP4、视黄醇、FGF10和FGF7后得到的培养基；/n(a5)完成步骤(a4)后，将所述细胞接种至分化培养基II，继续培养，直至获得肺上皮细胞；/n所述分化培养基II为在基础培养基中加入CHIR99021、IBMX、地塞米松、FGF10和FGF7后得到的培养基。/n

【技术特征摘要】
1.一种从前肠内胚层细胞分化产生肺上皮细胞的方法，包括如下步骤：
(a4)将前肠内胚层细胞接种至分化培养基I，培养8-12天；
所述分化培养基I为在基础培养基中加入CHIR99021、BMP4、视黄醇、FGF10和FGF7后得到的培养基；
(a5)完成步骤(a4)后，将所述细胞接种至分化培养基II，继续培养，直至获得肺上皮细胞；
所述分化培养基II为在基础培养基中加入CHIR99021、IBMX、地塞米松、FGF10和FGF7后得到的培养基。


2.一种从内胚层细胞分化产生肺上皮细胞的方法，包括如下步骤：
(a2)将内胚层细胞接种至分化培养基A，培养1-2天；
所述分化培养基A为在基础培养基中加入Dorsomorphin和SB431542后得到的培养基；
(a3)完成步骤(a2)后，将所述细胞接种至分化培养基B，培养1-3天，得到前肠内胚层细胞；
所述分化培养基B为在基础培养基中加入IWP2和SB431542后得到的培养基；
(a4)完成步骤(a3)后，将前肠内胚层细胞接种至分化培养基I，培养8-12天；
所述分化培养基I为在基础培养基中加入CHIR99021、BMP4、视黄醇、FGF10和FGF7后得到的培养基；
(a5)完成步骤(a4)后，将所述细胞接种至分化培养基II，继续培养，直至获得肺上皮细胞；
所述分化培养基II为在基础培养基中加入CHIR99021、IBMX、地塞米松、FGF10和FGF7后得到的培养基。


3.一种从胚胎干细胞分化产生肺上皮细胞的方法，包括如下步骤：
(a1)取胚胎干细胞，分化，获得内胚层细胞；
(a2)完成步骤(a1)后，将内胚层细胞接种至分化培养基A，培养1-2天；
所述分化培养基A为在基础培养基中加入Dorsomorphin和SB431542后得到的培养基；
(a3)完成步骤(a2)后，将所述细胞接种至分化培养基B，培养1-3天，得到前肠内胚层细胞；
所述分化培养基B为在基础培养基中加入IWP2和SB431542后得到的培养基；
(a4)完成步骤(a3)后，将前肠内胚层细胞接种至分化培养基I，培养8-12天；
所述分化培养基I为在基础培养基中加入CHIR99021、BMP4、视黄醇、FGF10和FGF7后得到的培养基；
(a5)完成步骤(a4)后，将所述细胞接种至分化培养基II，继续培养，直至获得肺上皮细胞；
所述分化培养基II为在基础培养基中加入CHIR99021、IBMX、地塞米松、FGF1...

【专利技术属性】
技术研发人员：向宽辉，范华昊，童贻刚，李彤，庄辉，赖鑫源，洪碧霞，陈杨桢，罗天明，宋立华，安小平，
申请(专利权)人：北京大学，北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11