SARS-CoV-2胃肠炎症动物模型的构建方法技术

本发明专利技术属于动物模型构建技术领域，公开了SARS‑CoV‑2引起的胃肠炎症动物模型的构建方法，是在模拟病毒感染之前，先对胃肠道上皮进行酸灌肠处理，添加的乙酸能够造成一个轻微的损伤，在进行酸灌肠处理后，再腹腔注射SARS‑CoV‑2 Spike Protein更有利于模拟小鼠病毒性胃肠道症状的重现；经过这种方式获得的动物模型与现有技术报道的有关COVID‑19患者的临床症状一致，因此本发明专利技术方法构建的动物模型可以复制临床COVID‑19患者的胃肠道表现。

【技术实现步骤摘要】
SARS-CoV-2胃肠炎症动物模型的构建方法
本专利技术涉及动物模型构建
，更具体地，涉及SARS-CoV-2胃肠炎症动物模型的构建方法。
技术介绍
2019冠状病毒病(COVID-19)，由SARS-CoV-2引起严重急性呼吸系统疾病，自2019年12月爆发以来已经引起全世界范围内的大流行。典型的呼吸道症状已被确认为SARS-CoV-2感染的共同特征，气道被确认为靶器官。然而，自从我们课题组提供第一个胃肠道的证据，且随着SARS-CoV-2感染研究深入，有胃肠道症状的病例的临床报告不断升级，这些症状通常表现为腹泻、厌食、恶心和呕吐。此外，无法解释的是，一些感染SARS-CoV-2的患者在发病时甚至在病程中仅表现出消化系统症状，说明胃肠道对SARS-CoV-2的高度易感性。病理上，腹部CT显示肠壁增厚。值得注意的是，在ICU患者中能观察到小肠壁增厚。然而，COVID-19患者胃肠道易感部位的系统特征以及胃肠道症状发生的机制尚不清楚，部分原因是缺乏专为SARS-CoV-2胃肠道感染设计的动物模型。截止2020年11月为止，新型冠状病毒肺炎疫情仍在国外，尤其是美国大肆流行，世界各国对于抗新型冠状病毒肺炎的疫苗、抗体、药物研究迅速推展开来，动物模型在上述研究中具有重要作用，甚至可能成为限制这些研究进展的主要因素，现有技术急需SARS-CoV-2胃肠道感染的动物模型的构建。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供SARS-CoV-2胃肠炎症动物模型的构建方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：SARS-CoV-2引起的胃肠炎症动物模型的构建方法，包括以下步骤：S1、小鼠禁食16～24h后进行麻醉；S2、从小鼠肛门注入乙酸，倒立小鼠，并对小鼠进行灌洗；S3、一段时间后小鼠腹腔注射SARS-CoV-2SpikeProtein；S4、数小时后即成功得到由SARS-CoV-2引起的胃肠炎症动物模型。现有技术有一些关于新型冠状病毒SARS-CoV-2的肺部感染动物模型，本专利技术在发现SARS-CoV-2Spike蛋白可能引起胃肠道水肿和炎症的前提下，旨在构建SARS-CoV-2引起的胃肠道炎症的动物模型，本专利技术研究发现，仅仅是用SARS-CoV-2SpikeProtein刺激只会引起胃肠道的轻度炎症，无法与人类所表现出的胃肠道炎症一致，为了模拟人类的感染途径，本专利技术在用腹腔注射SARS-CoV-2SpikeProtein之前，先对胃肠道上皮进行酸灌肠处理，添加的乙酸能够造成一个轻微的损伤，在进行酸灌肠处理后，再用SARS-CoV-2SpikeProtein刺激则更有利于SARS-CoV-2SpikeProtein的结合；经过这种方式获得的动物模型与现有技术报道的有关COVID-19患者的临床症状一致，因此本专利技术方法构建的动物模型可以复制临床COVID-19患者的胃肠道表现。前期对乙酸的浓度进行了考察，当选用5％的乙酸时，会造成严重的炎症和胃肠道损伤，不符合COVID-19患者的胃肠道表现，优选地，上述动物模型的构建方法中，步骤S2乙酸的浓度为1～2％，体积为500μL～1000μL。优选地，上述动物模型的构建方法中，步骤S2以到达结肠位置开始注入乙酸。另外，前期还对酸刺激所作用的时间进行了考察，发现在乙酸刺激并完成灌洗后16～24h时注射SARS-CoV-2SpikeProtein，就可以达到临床COVID-19患者的胃肠道损伤表现，因此，优选地，上述动物模型的构建方法中，步骤S3是在灌洗后16～24h对小鼠进行腹腔注射。优选地，上述动物模型的构建方法中，步骤S3所述SARS-CoV-2SpikeProtein的用量为5.5nM/kg小鼠体重。同样，还对腹腔注射SARS-CoV-2SpikeProtein的作用时间进行了优化，发现6h后即可以达到临床COVID-19患者的胃肠道损伤表现，且24h与6h的临床COVID-19患者的胃肠道损伤表现差异不明显。因此，优选地，上述动物模型的构建方法中，其特征在于，步骤S4所述数小时是指6～24h。作为一种具体的实施方式，上述动物模型的构建方法中，步骤S2所述注入乙酸的具体操作为：麻醉数分钟后，软管表面涂抹润滑剂，并将软管从小鼠肛门插入，插入深度以达到结肠位置为准，软管一端接上注射器，并注入乙酸。作为一种具体的实施方式，步骤S2所述灌洗的具体操作为：小鼠倒立后，用PBS进行灌洗，洗掉注入的乙酸。由于COVID-19病毒属于冠状病毒。冠状病毒是一种具有包膜的正链RNA病毒，属于冠状病毒亚科，其下分为4个属，包括α、β、γ和δ冠状病毒，而SARS-CoV病毒、MERS病毒和SARS-CoV-2病毒同属β冠状病毒。在以往发生的重大传染性疾病中，30％的中东呼吸综合征(MERS)患者和10.6％的SARS患者有腹泻症状，MERS更被证实存在于胃肠液中。可见消化道感染并引起胃肠道症状在冠状病毒中有普遍的代表意义。因此，可以预想的到，本专利技术上述动物模型的构建方法也适用于其他冠状病毒(例如MERS病毒)引起的胃肠道动物模型的构建。本专利技术还提供上述动物模型构建方法制备得到的动物模型，该动物模型能够复制临床COVID-19患者的胃肠道表现，可作为COVID-19引发的胃肠道炎症的治疗的工具。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了SARS-CoV-2引起的胃肠炎症动物模型的构建方法，是在腹腔注射SARS-CoV-2SpikeProtein之前，先对胃肠道上皮进行酸灌肠处理，添加的乙酸能够造成一个轻微的损伤，在进行酸灌肠处理后，再用SARS-CoV-2SpikeProtein刺激则更有利于SARS-CoV-2SpikeProtein的结合；经过这种方式获得的动物模型与现有技术报道的有关COVID-19患者的临床症状一致，因此本专利技术方法构建的动物模型可以复制临床COVID-19患者的胃肠道表现。附图说明图1为胃肠道炎症动物模型探索结果；其中，图1a为重组SARS-CoV-2Spike蛋白的结构示意图；重组SARS-CoV-2Spike蛋白由受体结合区(RBD，Arg319-Phe541)和C端Fc区组成；图1b为胃肠道不同部位的HE切片染色图；ig代表灌胃给药，ip代表腹腔注射给药；图2a显示动物构建流程；图2b显示实验组(Spike-Fc)和对照组(Control-Fc)不同部位的HE切片染色图；图2c和图2d显示胃肠道不同部位的免疫荧光染色图；图3a显示ACE2在胃肠道不同部位的表达情况；图3b显示构建的动物模型不同组织的HE切片染色图；图4为对比例1的方法构建的动物模型胃肠道不同部位的HE切片染色图；图5为对比例2的方法构建的动物模型胃肠道不同部位的HE切片染色图；图6为对比例3的方法构建的动物模型胃肠道不同部位的HE切片染色图。具体实施方式<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.SARS-CoV-2引起的胃肠炎症动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、小鼠禁食16～24h后进行麻醉；/nS2、从小鼠肛门注入乙酸，倒立小鼠，并对小鼠进行灌洗；/nS3、一段时间后小鼠腹腔注射SARS-CoV-2Spike Protein；/nS4、数小时后即成功得到由SARS-CoV-2引起的胃肠炎症动物模型。/n

【技术特征摘要】
1.SARS-CoV-2引起的胃肠炎症动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、小鼠禁食16～24h后进行麻醉；
S2、从小鼠肛门注入乙酸，倒立小鼠，并对小鼠进行灌洗；
S3、一段时间后小鼠腹腔注射SARS-CoV-2SpikeProtein；
S4、数小时后即成功得到由SARS-CoV-2引起的胃肠炎症动物模型。


2.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2引起的胃肠炎症动物模型的构建方法，其特征在于，步骤S2乙酸的浓度为1～2％v/v，体积为500μL～1000μL。


3.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2引起的胃肠炎症动物模型的构建方法，其特征在于，步骤S2以到达结肠位置开始注入乙酸。


4.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2引起的胃肠炎症动物模型的构建方法，其特征在于，步骤S3是在灌洗后16～24h...

【专利技术属性】
技术研发人员：何欢欢，曾发敏，何建忠，李颖雯，邓昭华，
申请(专利权)人：中山大学附属第五医院，
类型：发明
国别省市：广东;44