一种抑制人腺病毒增殖药物的高通量筛选方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种抑制人腺病毒增殖药物的高通量筛选方法及其应用。该专利中为标记GFP的人腺病毒在感染HEK‑293细胞后能表达绿色荧光蛋白，使感染的细胞在荧光显微镜下呈绿色。抗人腺病毒的药物活性通过以下实现，利用流式细胞术检测HEK‑293细胞在添加抗腺病毒药物和人腺病毒后，培养基上清中的腺病毒含量的变化。具体操作为，取适量的病毒上清重新加入一定量的HEK‑293细胞中，用流式细胞术测定细胞中被腺病毒感染的细胞的比率（带有绿色荧光的细胞），以此来评估添加药物对腺病毒增殖是否有明显的抑制作用。此方法，可以在体外快速、简便，低廉，有效，高通量的筛选候选药物分子是否具有抑制人腺病毒的作用。本专利将加速新型抗人腺病毒药物的研发。

【技术实现步骤摘要】
一种抑制人腺病毒增殖药物的高通量筛选方法及其应用
本专利技术涉及一种药物抑制人腺病毒增殖的高通量筛选方法及其应用，可以在体外快速、简便、有效、高通量的对药物是否具有抑制人腺病毒增殖作用进行筛选，有助于新型抗腺病毒药物的研发。
技术介绍
人腺病毒是线性、双链、二十面体的DNA病毒，至今有70种人类腺病毒被确认，根据其遗传亲缘关系分为7种（A-G）。不同的腺病毒种类有特定的器官偏好性，C、E、B类病毒感染呼吸道；一些B类病毒感染尿道；A和F的感染靶器官是胃肠道；D类主要感染眼睛，这可能和不同腺病毒的受体不同有关。C（血清学1、2、5）类主要引起幼儿轻微感染；B（血清学3、7、14、21）类和E类主要引起成年人感染。大多数腺病毒感染可能是亚临床的，但感染可以表现相对温和的上呼吸道疾病，以及更严重的细支气管炎和肺炎，以及腹泻和结膜炎。目前，没有批准的抗病毒药物用于特异的治疗腺病毒感染。虽然西多福韦（Cidofovir，C）和Brincidofovir被用于腺病毒治疗。西多福韦有严重的肾毒性。Brincidofovir(B)是西多福韦的磷脂偶联物，临床上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制人腺病毒增殖药物的高通量筛选方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：1）整合GFP的人腺病毒的制备；2）对人腺病毒滴度的检测，应用TCID

【技术特征摘要】
1.一种抑制人腺病毒增殖药物的高通量筛选方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：1）整合GFP的人腺病毒的制备；2）对人腺病毒滴度的检测，应用TCID50法进行检测；3）阳性药物（Brincidofovir，Cidofovir）对HEK-293细胞的MTT试验，使用MTT试剂盒，按照其说明书进行检测；4）药物抑制人腺病毒增殖的高通量筛选。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的整合GFP的人腺病毒的制备步骤为利用pAdTrack-CMV和pAdEasy-1质粒构建质粒pAd-YFP，将质粒pAd-YFP转染到293FT细胞获得整合GFP的人腺病毒。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于其中步骤4）的筛选方法包括24孔板筛选方法或48孔板筛选方法。


4.如权利要求3所述的方法，其中24孔板筛选方法具体为：
第1d，24孔板，每孔铺HEK-293细胞5×104（即用1mL培养基中含有5×104cells/mL，吸取1mL到24孔板中）；
第2d，铺板后24h，加药；试验应有（1）空白对照组（不加药，不加病毒组），（2）阳性病毒对照组（只加病毒，不加药组），（3）阳性药物组（加病毒，加阳性药物，西多福韦Cidofovir(50µM)和Brincidofovir(250nM)），（4）试验组（加病毒，加需要筛选的药物）；
加药后2h，加病毒，每孔加2µL人腺病毒（MOI=0.1）；空白对照组不加病毒；
第5d，加病毒后，第3d，铺细胞：24孔板，每孔1×105的HEK-293细胞（即用1mL培养基中含有1×105cells/mL，吸取1mL到24孔板中）；和第一次铺的细胞孔数一致；
第6d，取第一次铺板每孔的病毒上清100µL，到第二次铺板的细胞中，顺序和第一次一致；
第8d，即加病毒后第2d，对第2次铺的细胞板，弃上清，100µL胰酶消化，加200µL培养基进行中和，反复吹打后，吸入流式管中进行流式分析，并记录每个样品的检测结果；
将待测药物的流式结果和阳性药物组（西多福韦Cidofovir(50µM)和Brincidofovir(250nM)）进行比较，分析待测药物是否具有抑制人腺病毒的作用。


5.如权利要求3所述的方法，其中48孔板筛选方法具体...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷峰，商璐，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心，
类型：发明
国别省市：上海;31