一种YH66_10325基因改造的产L-异亮氨酸重组菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种基于YH66_10325基因的产L‑异亮氨酸的重组菌株及其构建方法与应用。本发明专利技术通过对YH66_10325基因的敲除，发现该基因编码的产物对L‑异亮氨酸生产能力产生影响，通过在编码序列引入点突变，或者增加该基因的拷贝数或过表达获得重组菌株，所述点突变是使YH66_10325基因序列第925位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，使编码的相应氨基酸序列第309位丙氨酸变为苏氨酸。所获得的菌株与未改造的菌株相比，有利于生产高浓度的L‑异亮氨酸。

【技术实现步骤摘要】
一种YH66_10325基因改造的产L-异亮氨酸重组菌株及其构建方法与应用
本专利技术属于基因工程和微生物
，具体涉及一种YH66_10325基因改造的产L-异亮氨酸重组菌株及其构建方法与应用。
技术介绍
L-异亮氨酸是人体八种必需氨基酸之一，同时又是三种支链氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。因此，已被广泛应用于食品、动物饲料和医药等行业。L-异亮氨酸的生产方法主要有蛋白质水解法、化学合成法和生物发酵法。生物发酵法因其原料成本低、易于控制、节能环保成为工业化生产的首选方法。目前，L-异亮氨酸的产量还不高，高产菌株的选育成为L-异亮氨酸产量提高的重要环节。生产L-异亮氨酸的菌株主要是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)和大肠杆菌(Escherichiacoli)。谷氨酸棒杆菌具有无内毒素、代谢同工酶少，有利于解除反馈抑制或转录衰减以及关键代谢酶抗反馈抑制能力强等特点，因此大多数研究者倾向于研究谷氨酸棒杆菌及其亚种，如谷氨酸棒杆菌(Brevibacteriumflavum)和乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)等。优良菌种的选育依然是高产L-异亮氨酸的关键，随着高通量筛选技术的发展，结合传统诱变技术，有助于找到未知性状的高产L-异亮氨酸突变株。虽然已筛选到一些可以提高L-异亮氨酸产量的菌株，但是为了满足日益增加的需求，仍需要找到更多高产L-异亮氨酸的突变株。
技术实现思路
r>针对现有技术的不足，本专利技术提供一种多核苷酸及含有该多核苷酸的重组菌株,以及将重组菌株用于改善细菌的L-异亮氨酸生产能力。为了实现上述目的，本专利技术的专利技术人研究发现，具有L-异亮氨酸生产能力的谷氨酸棒杆菌ATCC15168基因组(GenBank：CP011309.1)中YH66_10325基因(GenBank：AKF27920.1)，可以通过修饰该基因或改善其表达，获得L-异亮氨酸产量提高的重组菌株，与未改造的野生型菌株相比，重组菌株的产L-异亮氨酸能力更强。本专利技术采用如下技术方案实现：本专利技术的第一方面，提供了生成L-异亮氨酸的细菌，其具有编码如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达。根据本专利技术，所述改善的表达是所述多核苷酸表达增强，或者编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。所述SEQIDNO:3的氨基酸序列是基因YH66_10325编码的蛋白。所述细菌与未修饰菌株相比具有增强的L-异亮氨酸生产能力。在本专利技术中，术语“具有L-异亮氨酸生产能力的细菌”是指具有在培养基和/或细菌的细胞中以下述程度产生并累积目的L-异亮氨酸的能力，使得当细菌在培养基中培养时可以收集L-异亮氨酸的细菌。具有L-异亮氨酸生产能力的细菌可以是能够以比未修饰菌株可获得的量更大的量在培养基和/或细菌的细胞中积累目的L-异亮氨酸的细菌。术语“未修饰菌株”是指尚未以使得具有特定特征的方式进行修饰的对照菌株。即，未修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。在本专利技术中，除非另有说明，术语“L-异亮氨酸”是指游离形式的L-异亮氨酸、其盐或其混合物。所述多核苷酸可以编码与SEQIDNO:3的氨基酸序列具有约90％或更高、约92％或更高、约95％或更高、约97％或更高、约98％或更高、或约99％或更高的序列同源性的氨基酸序列。如本文中使用的，术语“同源性”指两种多核苷酸或两种多肽模块之间的百分比同一性。可以通过使用本领域中已知的方法测定一种模块和另一种模块之间的序列同源性。例如，可以通过BLAST算法测定此类序列同源性。可以如下增强多核苷酸的表达：通过取代或突变表达调节序列、对多核苷酸序列引入突变、通过经由染色体插入或载体导入的多核苷酸拷贝数的增加、或其组合等。可以修饰多核苷酸的表达调节序列。表达调节序列控制与其可操作连接的多核苷酸的表达，并且例如可以包括启动子、终止子、增强子、沉默子等。多核苷酸可以具有起始密码子的变化。可以将多核苷酸掺入染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。在本文，特定的位点可以包括例如转座子位点或基因间位点。另外，可以将多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。在本专利技术的一种实施方式中，通过将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。在本专利技术的一种实施方式中，通过将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而过表达所述核酸序列。在本专利技术的一种实施方式中，将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。在本专利技术的一种实施方式中，将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而过表达所述氨基酸序列。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述多核苷酸可以包含SEQIDNO:1的核苷酸序列。在本专利技术的一种实施方式中，编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸的具有点突变，使得SEQIDNO:3的氨基酸序列的第309位丙氨酸被不同的氨基酸所取代。根据本专利技术，优选第309位丙氨酸变为苏氨酸所取代。根据本专利技术，SEQIDNO:3所示的氨基酸序列，其中第309位丙氨酸变为苏氨酸所取代后的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。在本专利技术的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列是由SEQIDNO:1所示多核苷酸序列第925位碱基发生突变而形成的。根据本专利技术，所述突变包括SEQIDNO:1所示多核苷酸序列第925位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)。在本专利技术的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列包括SEQIDNO:2所示的多核苷酸序列。如本文中使用的，术语“可操作连接”指调节序列和多核苷酸序列之间的功能性连接，由此调节序列控制多核苷酸序列的转录和/或翻译。调节序列可以是能提高多核苷酸的表达水平的强启动子。调节序列可以是源自属于棒杆菌属的微生物的启动子或者可以是源自其它微生物的启动子。例如，启动子可以是trc启动子、gap启动子、tac启动子、T7启动子、lac启动子、trp启动子、araBAD启动子或cj7启动子。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述启动子是编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸(YH66_10325)的启动子。如本文中使用的，术语“载体”指含有基因的调节序列和基因序列并且配置为在合适的宿主细胞中表达靶基因的多核苷酸构建体。或者，载体又可以指多核苷酸构建体，其含有可用于同源重组的序列，从而由于对宿主细胞导入的载体，可以改变宿主细胞的基因组中的内源基因的调节序列，或者可以将可以表达的靶基因插入宿主的基因组的特定位点中。在这点上，本专利技术中使用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多核苷酸，其特征在于，包括编码含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多核苷酸，其中第309位丙氨酸被不同的氨基酸所取代；优选第309位丙氨酸被苏氨酸所取代；/n优选所述多核苷酸包括编码含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的多核苷酸；/n优选所述多核苷酸是由SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第925位碱基发生突变而形成的；优选所述突变是SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第925位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)；/n优选所述多核苷酸包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种多核苷酸，其特征在于，包括编码含有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列的多核苷酸，其中第309位丙氨酸被不同的氨基酸所取代；优选第309位丙氨酸被苏氨酸所取代；
优选所述多核苷酸包括编码含有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的多核苷酸；
优选所述多核苷酸是由SEQIDNO:1所示多核苷酸序列第925位碱基发生突变而形成的；优选所述突变是SEQIDNO:1所示多核苷酸序列第925位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)；
优选所述多核苷酸包括SEQIDNO:2所示的多核苷酸序列。


2.一种蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。


3.含有权利要求1所述的多核苷酸和/或权利要求2所述的蛋白的重组载体、表达盒、转基因细胞系和/重组菌。


4.权利要求1所述的多核苷酸、权利要求2所述的蛋白、权利要求3所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系和/重组菌在生产L-异亮氨酸中的应用。


5.一种生成L-异亮氨酸的细菌，其特征在于，具有编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达；
优选，所述改善的表达是编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸的表达增强，或者编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。


6.如权利要求5所述的细菌，其特征在于，编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸的点突变，使得SEQIDNO:3的氨基酸序列的第309位丙氨酸被不同的氨基酸所取代；优选第309位丙氨酸被苏氨酸所取代。


7.如权利要求5或6所述的细菌，其特征在于，编码SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭小炜，赵春光，孟刚，魏爱英，杨立鹏，田斌，马风勇，周晓群，苏厚波，
申请(专利权)人：宁夏伊品生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：宁夏;64