灵芝丙酮酸转运蛋白基因在调控灵芝纤维素酶活性中的应用制造技术

本发明专利技术公开了灵芝丙酮酸转运蛋白基因在调控纤维素酶中的应用，该灵芝丙酮酸转运蛋白基因为如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因中的至少一种。通过沉默灵芝菌丝体中的灵芝丙酮酸转运蛋白基因提高灵芝纤维素酶活性。本专利通过RNA干扰技术，提供了丙酮酸转运蛋白在调节灵芝纤维素酶活性中的重要作用，为通过代谢调控手段提高灵芝纤维素酶活性提供了理论基础。

【技术实现步骤摘要】
灵芝丙酮酸转运蛋白基因在调控灵芝纤维素酶活性中的应用
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及灵芝丙酮酸转运蛋白基因在调控纤维素酶中的应用。
技术介绍
纤维素作为植物细胞壁的主要成分，它在地球上的储量丰富，同时，纤维素的分解和利用是地球碳循环不可缺少的一部分。而灵芝属于木腐菌，能够通过分泌糖基水解酶和其他碳水化合物活性酶(CAZymes)来降解植物细胞壁中的碳水化合物聚合物，包括纤维素，半纤维素和果胶。Chen等人通过对灵芝进行全基因组测序发现，灵芝含有417个水解酶基因(CAZymes)，是目前报道的含有水解酶最丰富的担子菌之一。因此，灵芝在纤维素降解方面具有基因优势，值得深入研究。纤维素作为一种多糖，它需要分解为葡萄糖才能被生物体利用。而有研究表明，在纤维素分解的初始阶段，葡萄糖被大量生成，约有一半的纤维素在24小时内被水解了，但剩下的纤维素被水解完全则需要两天以上。进一步研究显示，葡萄糖浓度对纤维素的水解具有显著的抑制作用。因此，如何降低纤维素水解产生的葡萄糖浓度对于提高纤维素利用是一个关键因素。葡萄糖在灵芝内代谢途径主要有两种：糖酵解途径和戊糖磷酸途径，其中糖酵解途径不但能够提供能量，而且能够提供中间代谢产物，被认为是葡萄糖代谢的主要方式。因此提高糖酵解速率降低葡萄糖含量，进而提高纤维素利用似乎是一种行之有效的手段。糖酵解的速率受到多种因素的制约，如ATP和柠檬酸的抑制。因此如何增加糖酵解速率是提高葡萄糖利用的一个关键因素。文献表明，酿酒酵母在以葡萄糖为碳源条件下高速生长，且此时酵母进行高速率的糖酵解来提高能量，而这种代谢重排依赖于线粒体丙酮酸载体(MPC)。MPC是异二聚体，镶嵌于线粒体内膜，是丙酮酸进入线粒体的必须载体。在骨骼肌细胞中，检测MPC敲除细胞中的代谢通量，结果表明MPC沉默条件下，EMP途径显著增强。因此MPC可能通过负调控糖酵解来促进细胞对纤维素的利用。基于以上背景，本专利通过RNA干扰技术成功构建了丙酮酸转运蛋白基因的沉默菌株，以此为材料研究了该基因在调控灵芝纤维素酶活性中的重要作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种灵芝丙酮酸转运蛋白基因及其所编码的丙酮酸转运蛋白。本专利技术的另一目的在于提供上述灵芝丙酮酸转运蛋白基因及其所编码的丙酮酸转运蛋白在调节灵芝纤维素酶活性中的应用。本专利技术的又一目的在于提供一种提高灵芝纤维素酶活性的方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：本专利技术提供的一种灵芝丙酮酸转运蛋白基因，它包括两个同源基因MPC1和MPC2，所述的同源基因MPC1和MPC2分别具有如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。同源基因MPC1和MPC2的cDNA全长分别为384bp和402bp。由上述灵芝丙酮酸转运蛋白基因编码的丙酮酸转运蛋白，如SEQIDNO.1所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因编码的丙酮酸转运蛋白具有如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列，如SEQIDNO.2所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因编码的丙酮酸转运蛋白具有如SEQIDNO.4所示的氨基酸序列；分别含有127和133个氨基酸。一种灵芝丙酮酸转运蛋白基因沉默载体，该载体采用以下步骤构建：设计正、反向上游引物，以灵芝总cDNA为模板进行PCR扩增获得灵芝丙酮酸转运蛋白基因的靶向干扰片段，并将所获得的靶向干扰片段插入到沉默载体pAN7-dual的KpnI和SpeI酶切位点之间得到灵芝丙酮酸转运蛋白基因沉默载体。用于扩增如SEQIDNO.1所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因的靶向干扰片段的正、反向上游引物如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示，用于扩增如SEQIDNO.2所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因的靶向干扰片段的正、反向上游引物如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。MPC1正向上游引物：CTAGGGTACCATGGCCTCCAAAGTCGTCC(SEQIDNO.5)MPC1反向上游引物：CTAGACTAGTTCATTTTGAGACGGAG(SEQIDNO.6)MPC2正向上游引物：CTAGGGTACCATGTCGGGAGCAGC(SEQIDNO.7)MPC2反向上游引物：CTAGGGATCCATGTCGGGAGCAGCGGC(SEQIDNO.8)本专利技术所述丙酮酸转运蛋白基因沉默的方法，具体为：首先通过PCR扩增获得灵芝丙酮酸转运蛋白基因的靶向干扰片段，并加入适当酶切位点(KpnI和SpeI)后连接入基因沉默载体中，构建基因沉默载体。然后将构建完成的两种基因沉默载体进行分别电穿孔转化，通过潮霉素抗性筛选，初步获得抗性转化子。最后经连续5代在不含有潮霉素的培养基上培养，验证转化子的稳定性。如SEQIDNO.1或/和SEQIDNO.2所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因在调节灵芝纤维素酶活性中的应用。上述的应用为通过沉默灵芝菌丝体中所述的灵芝丙酮酸转运蛋白基因提高灵芝纤维素酶活性；优选的，通过沉默灵芝菌丝体中如SEQIDNO.1或/和SEQIDNO.2所示的两个丙酮酸转运蛋白基因提高灵芝纤维素酶活性。其中，所述沉默灵芝菌丝体中丙酮酸转运蛋白基因的过程为：构建两个灵芝丙酮酸转运蛋白基因沉默载体并分别转化灵芝原生质体，通过抗性筛选获得丙酮酸转运蛋白基因沉默的阳性转化子以及沉默灵芝菌丝体中丙酮酸转运蛋白基因。如SEQIDNO.3或/和SEQIDNO.4所示的灵芝丙酮酸转运蛋白在调节灵芝纤维素酶活性中的应用。上述的灵芝丙酮酸转运蛋白基因沉默载体在调节灵芝纤维素酶活性中的应用。该应用将所述的灵芝丙酮酸转运蛋白基因沉默载体转化灵芝原生质体，通过抗性筛选获得丙酮酸转运蛋白基因沉默的阳性转化子并进行培养。一种提高灵芝纤维素酶活性的方法，通过沉默灵芝菌丝体中的丙酮酸转运蛋白基因来提高灵芝纤维素酶活性。优选的，通过沉默灵芝菌丝体中如SEQIDNO.1或/和SEQIDNO.2所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因提高灵芝纤维素酶活性。沉默灵芝菌丝体中如SEQIDNO.1或/和SEQIDNO.2所示的两种丙酮酸转运蛋白基因的过程为：设计正、反向上游引物，以灵芝总cDNA为模板进行PCR扩增分别获得如SEQIDNO.1所示的丙酮酸转运蛋白基因的靶向干扰片段和如SEQIDNO.2所示的丙酮酸转运蛋白基因的靶向干扰片段，并将所获得的靶向干扰片段分别插入到沉默载体pAN7-dual的KpnI和SpeI酶切位点之间得到如SEQIDNO.1所示丙酮酸转运蛋白基因的沉默载体和如SEQIDNO.2所示丙酮酸转运蛋白基因的沉默载体并分别转化灵芝原生质体，通过抗性筛选获得阳性转化子以沉默灵芝菌丝体中的丙酮酸转运蛋白基因；用于扩增如SEQIDNO.1所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因的靶向干扰片段的正、反向上游引物如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示，用于扩增如SEQIDNO.2所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因的靶向干扰片段的正、反向上游引物如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。本专利技术还提供灵芝内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶活性的检测方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种灵芝丙酮酸转运蛋白基因，其特征在于，该基因为如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因中的至少一种。/n

【技术特征摘要】
1.一种灵芝丙酮酸转运蛋白基因，其特征在于，该基因为如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因中的至少一种。


2.由权利要求1所述的灵芝丙酮酸转运蛋白基因编码的丙酮酸转运蛋白，其特征在于，如SEQIDNO.1所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因编码的丙酮酸转运蛋白具有如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列，如SEQIDNO.2所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因编码的蛋白具有如SEQIDNO.4所示的氨基酸序列。


3.一种灵芝丙酮酸转运蛋白基因沉默载体，其特征在于：该载体采用以下步骤构建：设计正、反向上游引物，以灵芝总cDNA为模板进行PCR扩增获得如权利要求1所述的灵芝丙酮酸转运蛋白基因的靶向干扰片段，并将所获得的靶向干扰片段插入到沉默载体pAN7-dual的KpnI和SpeI酶切位点之间得到灵芝丙酮酸转运蛋白基因沉默载体；用于扩增如SEQIDNO.1所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因的靶向干扰片段的正、反向上游引物如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示，用于扩增如SEQIDNO.2所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因的靶向干扰片段的正、反向上游引物如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。


4.权利要求1所述的灵芝丙酮酸转运蛋白基因在调节灵芝纤维素酶活性中的应用。


5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：通过沉默灵芝菌丝体中如权利要求1所述的灵芝丙酮酸转运蛋白基因提高灵芝纤维素酶活性；优选的，通过沉默灵芝菌丝体中如SEQIDNO.1或/和SEQIDNO.2所示的两种灵芝丙酮酸转运蛋白基因提高灵芝纤维素酶活性。


6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述沉默灵芝菌丝体中如权利要求1所述的丙酮酸转运蛋白基因的过程为：分别...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵明文，徐文照，师亮，任昂，朱静，刘锐，于汉寿，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32