一种BNP抗原决定簇多肽及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种BNP抗原决定簇多肽及其应用。其中所述BNP蛋白抗原决定簇多肽的氨基酸序列为Ser‑Ser‑Ser‑Gly‑Leu‑Gly‑Cys‑Lys‑Tyr。本发明专利技术所述的BNP蛋白抗原是通过使用所述的抗原决定簇多肽与载体蛋白偶联制备的。本发明专利技术所述的BNP蛋白抗体是由所述抗原制备成的单克隆抗体。本发明专利技术所述的单克隆抗体可用于制备BNP蛋白检测试剂盒。本发明专利技术所述的BNP蛋白抗原决定簇多肽具有良好的抗原性，使用其制备的抗原免疫动物能够产生特异性的抗体，使用其制备的BNP蛋白抗原具有良好的免疫原性，使用其制备的BNP蛋白可以特异性地结合人血清中的BNP，使用其制备的BNP蛋白检测试剂盒可有效检测人血清中的BNP蛋白水平。

【技术实现步骤摘要】
一种BNP抗原决定簇多肽及其应用
本专利技术涉及多肽化学领域，具体为一种BNP抗原决定簇多肽及其应用。
技术介绍
急性心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血硬气的心肌坏死，患者多发生在冠状动脉粥样硬化狭窄基础上，由于某些诱因致使冠状动脉粥样斑块破裂，血中的血小板在破裂的斑块表面聚集，形成血块（血栓），突然阻塞冠状动脉管腔，导致心肌缺血坏死。急性心肌梗死常引发心律失常、休克或心力衰竭等严重临床后果。中国的急性心肌梗死的发病率呈明显上升趋势，每年新发至少50万，现存患者超过200万。急性心肌梗死具有发病急、预后差和死亡率高的特点，其预后更是降低疾病死亡率的重要环节。因此临床上多使用各种方式进行病情监测和预后评估，脑利钠肽（Brainnatriureticpeptide，BNP）的水平正是监测病情反应预后情况的标志物之一。BNP是利钠肽家族的成员之一，来源于心脏，是一种心脏激素。BNP于1988首次在猪脑中发现，后来在人的心脏中分离纯化出且发现心脏的分泌量高于脑部。当心肌细胞受到压力或牵拉刺激后，首先形成B型利钠肽原前体（pre-proBNP），pre-proBNP是由134个氨基酸组成的分子，并在心肌细胞内储存，当pre-proBNP在由心肌细胞中向外分泌时或分泌后会被蛋白酶分解为N端的26个氨基酸组成的信号肽和由108个氨基酸组成的B型利钠肽原（proBNP），后者在内切酶的作用下进一步裂解含有32个氨基酸组成的活性B型利钠肽（BNP）和一个由N端76个氨基酸构成的无活性的B型利钠肽（NT-proBNP）。二者均由心肌细胞分泌到血液中，可作为心血管疾病的标志物。但是NT-proBNP临床上使用复杂且易受肾功能影响，因此BNP作为心衰标志物更优于NT-proBNP。关于BNP的测定，一些方法是通过识别BNP的环状结构，并据此制备对应抗体；另一些方法是能够通过识别包括SEQIDNO.2：KVLRRH、SEQIDNO.3：SPKMVQGSGC、SEQIDNO.4：VQGSGCFGR、SEQIDNO.5：MDRISSSSGLG在内的一些抗原决定簇人工序列的单克隆抗体来检测BNP含量的。本专利技术提出了一种BNP抗原决定簇多肽及其应用，所述的多肽序列区别于任何一种已知的BNP表面抗原决定簇，且具有抗原性和特异性，可用于制备对应的抗体，同时制备出的抗体也具有良好的免疫原性。
技术实现思路
本专利技术提供一种BNP抗原决定簇多肽及其应用，所述的抗原决定簇抗原性高特异性强，可用于制备对应的BNP抗原和抗体，同时提供使用该抗原决定簇多肽制备的抗体进行BNP检测的试剂盒。第一方面，本专利技术提供一种BNP抗原决定簇多肽，所述抗原决定簇多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，具体为：Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Lys-Tyr。人BNP的氨基酸序列全长为32个氨基酸（Swiss-Prot登录号：P16860.1），本专利技术提供的抗原决定簇多肽对应全长氨基酸序列的第20至27位，并在C末端加上氨基酸Y得到，总计含有9个氨基酸。上述BNP抗原决定簇多肽的筛选原则为：1.亲水性强；2.抗原性强；3.易于合成。同时本专利技术提供的BNP抗原决定簇多肽免疫原性强，使用所述抗原决定簇与载体蛋白结合后，可刺激抗原免疫动物制备单克隆抗体，使用该抗原决定簇制备的抗体可以特异性结合人BNP蛋白。C末端添加氨基酸Y是为了使抗原决定簇通过双偶氮联苯胺（Bis-diazotizedbenzidine，BDB）交联到载体蛋白上，并作为抗原制备抗体。本专利技术中Y氨基酸加在C末端，最终制备的抗体为抗多肽N端抗体，Y氨基酸也可加在N末端，制备抗多肽C端抗体。上述BNP抗原决定簇多肽片段可使用固相法合成，合成方法参见实施例1。BNP抗原决定簇多肽分子量为1045.3，可用质谱确定其分子量。第二方面，本专利技术提供一种BNP蛋白抗原，所述BNP蛋白抗原是通过使用如第一方面所述的抗原决定簇多肽与载体蛋白偶联制备。可用的载体蛋白包括血蓝蛋白（Keyholelimpethemacyanin，KLH）、牛血清白蛋白（Bovineserumalbumin，BSA）和卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）等。制备方法采用现有成熟技术，参见实施例2。第三方面，本专利技术提供一种BNP蛋白抗体，所述BNP蛋白抗体是通过使用如第二方面所述的抗原制备的单克隆抗体。制备方法采用现有成熟技术，参见实施例2。第四方面，本专利技术提供一种如第三方面所述BNP蛋白抗体在制备BNP蛋白检测试剂盒上的应用。第五方面，本专利技术提供一种BNP蛋白检测试剂盒。本专利技术提供的BNP蛋白检测试剂盒优选采用ELISA竞争法测定人BNP蛋白，所述试剂盒包含包被抗体、酶标记的第二抗体等必要试剂。此外，所述BNP蛋白检测试剂盒还可以包含测定所需的任何试剂或工具，如预包被板、洗涤液、终止液等。本专利技术还提供了所述BNP蛋白检测试剂盒在定量测定BNP蛋白中的应用，参见实施例3。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效益：1.本专利技术提供的一种BNP蛋白抗原决定簇多肽具有良好的抗原性，使用其制备的抗原免疫动物能够产生特异性的抗体；2.本专利技术提供的一种BNP蛋白抗原具有良好的免疫原性，可刺激抗原免疫动物发生免疫应答；3.本专利技术提供的一种BNP蛋白抗体可以特异性地结合人血清中的BNP；4.本专利技术提供的一种BNP蛋白检测试剂盒可有效检测人血清中的BNP蛋白水平。附图说明图1为BNP蛋白检测试剂盒中BNP标准品浓度与吸光度标准曲线。具体实施方式为了能够更清楚地理解本专利技术专利的
技术实现思路
，特通过以下具体实施方式的描述进一步说明。本专利技术所用数据具有相关领域普通技术人员通常理解的含义。然而，为了更好地理解本专利技术，对一些定义和相关术语的解释如下：如本专利技术所使用的术语“抗原决定簇”，指决定抗原性的化学基团，多位于抗原物质表面，可以由连续的氨基酸序列或不连续的蛋白质三维结构组成。本文所使用的“抗原决定簇”特指BNP蛋白的抗原决定簇多肽。实施例1.BNP蛋白抗原决定簇的制备。本专利技术所述的BNP蛋白抗原决定簇的制备方法采用化学固相法合成抗原决定簇，原理是将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后依次进行缩合反应并延长肽链，直至抗原决定簇制备完成。下面具体描述本专利技术的BNP蛋白抗原决定簇的制备步骤。1.试剂与原料：HMPresin（P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂，Wang树脂）；Fmoc-AA（9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸）；NMP（氮甲基吡咯烷酮）；DCM（二氯甲烷）；MeoH（甲醇）；Piperidine（哌啶）；DMAP（二甲基氨基吡啶）；HOBT（羟基苯并三唑）；DCC（二环已基碳二亚胺）；TFA（三氟乙酸）；EDT（1，2-乙二硫醇）本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种BNP蛋白抗原决定簇多肽，所述的BNP蛋白抗原决定簇多肽的氨基酸序列为SEQID NO.1所示，具体为：Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Lys-Tyr。/n

【技术特征摘要】
1.一种BNP蛋白抗原决定簇多肽，所述的BNP蛋白抗原决定簇多肽的氨基酸序列为SEQIDNO.1所示，具体为：Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Lys-Tyr。


2.一种BNP蛋白抗原，所述的BNP蛋白抗原是通过使用权利要求1所述的BNP蛋白抗原决定簇与载体蛋白偶联制备的。


3.一种BNP蛋白抗体，所述的BNP蛋白抗体是由权利要求2所述的BNP蛋白抗原制备成的单克隆抗体。

【专利技术属性】
技术研发人员：罗奇斌，申玉林，任毅，廖胜光，
申请(专利权)人：天津奇云诺德生物医学有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12