聚乙二醇修饰的rhBNP及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种聚乙二醇修饰的rhBNP及其制备方法。具体地，本发明专利技术提供了一种新的聚乙二醇修饰的rhBNP制备方法，并基于该方法制备了相应的聚乙二醇修饰的rhBNP的药物组合物。本发明专利技术的方法可以提高rhBNP的N‑末端单聚乙二醇化的专一性及产品纯度，可以得到基本均一的N‑末端单PEG修饰的rhBNP产品。

【技术实现步骤摘要】
聚乙二醇修饰的rhBNP及其制备方法
本专利技术涉及生物医药领域，更具体地涉及一种聚乙二醇修饰的rhBNP及其制备方法。
技术介绍
B型尿钠肽，又称脑尿钠肽(Brainnatriureticpeptide，BNP)，是由心肌细胞合成的具有生物学活性的天然激素，主要在心室表达，主要用于调节心脏功能。心肌细胞所分泌的BNP先以108个氨基酸组成的前体形式存在，当心肌细胞受到刺激时，在活化酶的作用下裂解为由76个氨基酸组成的无活性直线多肽氨基端片段(1-76aa)和32个氨基酸组成的有活性环状多肽BNP-32释放入血循环，分别被称为NT-proBNP和BNP。蛋白治疗药物rhBNP的生物利用度通常受血浆半衰期的限制，并且对蛋白酶降解敏感，阻碍了最大的临床潜能。市售rhBNP均为短效产品，半衰期为18分钟，且需要慢速静脉滴注24小时以上，这给病人带来很大痛苦。PEG-rhBNP就是用PEG(聚乙二醇)对rhBNP进行修饰，从而降低rhBNP的免疫原性并延长其半衰期。但是PEG修饰rhBNP存在多种杂质，如未反应的原料：PEG、rhBNP；如多取代的PEG-rhBNP：di-PEG-rhBNP、tri-PEG-rhBNP；如其它取代单位的PEG-rhBNP，等杂质的大量存在，对产品质量产生一定影响。因此，本领域迫切需要开发一种新的聚乙二醇修饰的rhBNP制备方法，提高rhBNP的N-末端单聚乙二醇化的专一性及产品纯度。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种聚乙二醇修饰的rhBNP及其制备方法。本专利技术另一方面还提供一种上述N-末端mono-PEG-rhBNP药物组合物，包含上述N-末端mono-PEG-rhBNP药物活性组合物及药学上可接受的载体，通常将其制成冻干制品或者液体制品，优选冻干粉针剂，这些制剂可采用本领域一般技术人员公知的相应辅料，采用相应公知的药物制剂的制备技术制得。本专利技术另一方面还提供上述N-末端mono-PEG-rhBNP药物活性组合物或包含其的药物组合物在制备用于治疗以心力衰竭为特征的疾病的药物中的应用。在本专利技术的第一方面，提供了一种修饰型rhBNP的制备方法，包括步骤：(a)将rhBNP与聚乙二醇进行偶联反应，从而获得修饰型rhBNP粗品；和(b)对步骤(a)获得的修饰型rhBNP进行纯化处理，从而获得所述的修饰型rhBNP。在另一优选例中，所述的步骤(b)包括：(b1)对步骤(a)获得的修饰型rhBNP进行第一次离子交换层析，利用柠檬酸和氯化钠的柠檬酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集经证实含修饰型rhBNP的洗脱峰，从而获得含所述修饰型rhBNP的洗脱液I，和(b2)对步骤(b1)获得的洗脱液I进行第二次离子交换层析，利用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰，从而获得所述修饰型rhBNP。在另一优选例中，在步骤(b1)中，利用SPSepharoseFastFlow色谱柱进行第一次离子交换层析。在另一优选例中，在步骤(b1)中，利用缓冲液A和缓冲液B进行梯度洗脱，其中，所述的缓冲液A为5-20mM，较佳地8-12mM的柠檬酸缓冲液，所述缓冲液B为缓冲液A的1M氯化钠的混合溶液。在另一优选例中，在步骤(b1)中，所述的洗脱峰为经电泳证实含修饰型rhBNP的洗脱峰2。在另一优选例中，在步骤(b1)中，利用缓冲液A对步骤(a)获得的修饰型rhBNP粗品进行稀释，稀释后的修饰型rhBNP粗品的浓度为100-350μg/mL。在另一优选例中，在步骤(b1)中，稀释后的修饰型rhBNP的上样流速为5cm/min±20％，较佳地为4.5-5.5cm/min。在另一优选例中，在步骤(b1)中，稀释后的修饰型rhBNP的上样量为15-25个柱体积。在另一优选例中，在步骤(b1)中，在进行洗脱前，先用所述缓冲液A进行冲洗，较佳地，用缓冲液A以3cm/min±10％的流速冲洗2个柱体积。在另一优选例中，在步骤(b1)中，以缓冲液A和缓冲液B以5cm/min±20％的流速梯度洗脱15-25个柱体积。在另一优选例中，在步骤(b1)中，所述梯度为0至90％±10％。在另一优选例中，在步骤(b1)中，所述的洗脱峰为经电泳证实含修饰型rhBNP的洗脱峰4。在另一优选例中，在步骤(b2)中，利用SPSepharoseFastFlow色谱柱进行第二次离子交换层析。在另一优选例中，在步骤(b2)中，利用柠檬酸-氯化钠的柠檬酸盐缓冲液对步骤(b1)获得的洗脱液I进行稀释，稀释后的修饰型rhBNP的浓度为100-350μg/mL。在另一优选例中，在步骤(b2)中，在进行洗脱前，先用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液进行平衡，其中，所述磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液的浓度为10-30mM，较佳地15-25mM。在另一优选例中，在步骤(b2)中，以5cm/min±20％的流速进行冲洗。在另一优选例中，在步骤(b2)中，所述磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液的洗脱流速为5cm/min±20％。在另一优选例中，在步骤(b2)中，进行洗脱的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液的浓度为5-20mM，较佳地8-12mM。在另一优选例中，在步骤(b2)中，所述洗脱为等度洗脱。在另一优选例中，在步骤(b2)中，还包含去除洗脱峰4中包含的水分的步骤。在另一优选例中，在步骤(a)中，在还原剂存在的条件下进行所述偶联反应，较佳地，所述的还原剂选自下组：氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、醋酸硼氢化钠、硼氢化钠、或其组合。在另一优选例中，所述的还原剂为氰基硼氢化钠。在另一优选例中，在pH3-7，较佳地在pH4-6的条件下，进行偶联反应。在另一优选例中，利用缓冲溶液调节pH，较佳地，所述缓冲溶液为醋酸缓冲液或柠檬酸缓冲液。在另一优选例中，所述偶联反应的反应时间为4-20小时，较佳地为8-18小时，更佳地为10-14小时。在另一优选例中，所述的偶联反应的反应温度为0-28℃，较佳地为10-25℃；更优选地，为15-25℃。在另一优选例中，所述聚乙二醇与所述rhBNP的摩尔比为1：(0.2-4)，较佳地为1：(0.5-3)，更佳地为1：(0.8-2)。在另一优选例中，所述步骤(a)包括：(a1)将rhBNP和聚乙二醇混合，调节pH为4-6，从而获得反应混合液，其中所述聚乙二醇与所述rhBNP的摩尔比为1：(0.5-3)，(a2)在0-28℃的条件下，将步骤(a)反应混合液在搅拌条件下反应4-20小时；(a3)对步骤(b)所得的混合液进行分离，从而获得所述修饰型rhBNP。在另一优选例中，步骤(a1)中，所述的反应混合物中，所述rhBNP的浓度为0.5-8mg/ml，较佳地为1-6mg/ml。在另一优选例中，步骤(a1)中，所述的缓冲溶液为柠檬酸缓冲液或醋酸缓冲液。在另一优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种修饰型rhBNP的制备方法，其特征在于，包括步骤：/n(a)将rhBNP与聚乙二醇进行偶联反应，从而获得修饰型rhBNP粗品；和/n(b)对步骤(a)获得的修饰型rhBNP进行纯化处理，从而获得所述的修饰型rhBNP。/n

【技术特征摘要】
1.一种修饰型rhBNP的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将rhBNP与聚乙二醇进行偶联反应，从而获得修饰型rhBNP粗品；和
(b)对步骤(a)获得的修饰型rhBNP进行纯化处理，从而获得所述的修饰型rhBNP。


2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(b)包括：
(b1)对步骤(a)获得的修饰型rhBNP进行第一次离子交换层析，利用柠檬酸和氯化钠的柠檬酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集经证实含修饰型rhBNP的洗脱峰，从而获得含所述修饰型rhBNP的洗脱液I，和
(b2)对步骤(b1)获得的洗脱液I进行第二次离子交换层析，利用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液进行洗脱，收集经证实含修饰型rhBNP的洗脱峰，从而获得所述修饰型rhBNP。


3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b1)中，利用缓冲液A和缓冲液B进行梯度洗脱，其中，所述的缓冲液A为5-20mM，较佳地8-12mM的柠檬酸缓冲液，所述缓冲液B为缓冲液A的1M氯化钠的混合溶液。


4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(a)中，在还原剂存在的条件下进...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭红卫，韩为跃，张磊，俞亚波，王冲，万云雷，何小林，
申请(专利权)人：江苏璟泽生物医药有限公司，上海景泽生物技术有限公司，成都景泽生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32